Name: organotypic slice cultures of embryonic ventral midbrain: a system to study dopaminergic neuronal development in vitro
Uploaded: 2012-01-31T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro at JoVE.com

Nous remercions Martine Emond et Isabel Brachmann pour leur aide dans l&#39;établissement du système de tranches organotypiques culture et Wolfgang Hübner et Liviu Gabriel Bodea pour la lecture critique du manuscrit. Nous tenons à remercier Frank Costantini pour le R26 souris Cliff Tabin journaliste et pour les souris CREER Shh. Cette étude a été financée par une bourse de recherche du ministère de la Science et la Recherche de la Rhénanie du Nord Westphalie (Programm zur Förderung der Rückkehr des wissenschaftlichen aus dem Ausland Spitzennachwuchses).

Certaines parties du présent protocole sont modifiées de Daza et al., 2007 7. 1. Préparatifs <ol><li> Peut être préparé un jour à l&#39;avance <ol><li> Préparer 1X tampon de Krebs (1,5 L): 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,2 mM NaH 2 PO 4: H 2 O, 1,2 mM de MgCl2, 2,5 mM de CaCl2, 11 mM de glucose, 25 mM NaHCO 3; ajuster le pH à 7,4. Stériliser par filtration (0,22 um taille des pores...

<ol>
	<li>Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases.">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nat. Neurosci. 7 (2), 136-136 (2004).</li><li>Martini, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biased+selection+of+leading+process+branches+mediates+chemotaxis+during+tangential+neuronal+migration.">Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration.</a> Development. 136 (1), 41-41 (2009).</li><li>Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guiding+neuronal+cell+migrations.">Guiding neuronal cell migrations.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2 (2), a001834-a001834 (2010).</li><li>Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trekking+across+the+brain:+the+journey+of+neuronal+migration.">Trekking across the brain: the journey of neuronal migration.</a> Cell. 128 (1), 29-29 (2007).</li><li>Smidt, M. P., Burbach, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+mesodiencephalic+dopaminergic+neuron.">How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron.</a> Nat. Rev. Neurosci. 8 (1), 21-21 (2007).</li><li>Legue, E., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+fate+mapping+using+site-specific+recombinases.">Genetic fate mapping using site-specific recombinases.</a> Methods. Enzymol. 477, 153-153 (2010).</li><li>Daza, R. A., Englund, C., Hevner, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+culture+of+embryonic+brain+tissue.">Organotypic slice culture of embryonic brain tissue.</a> CSH Protoc. , (2007).</li><li>Harfe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+an+expansion-based+temporal+Shh+gradient+in+specifying+vertebrate+digit+identities.">Evidence for an expansion-based temporal Shh gradient in specifying vertebrate digit identities.</a> Cell. 118 (4), 517-517 (2004).</li><li>Srinivas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus.">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Dev. Biol. 1, 4-4 (2001).</li><li>Joksimovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporally+separable+Shh+domains+in+the+midbrain+define+distinct+dopaminergic+progenitor+pools.">Spatiotemporally separable Shh domains in the midbrain define distinct dopaminergic progenitor pools.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (45), 19185-19185 (2009).</li><li>Blaess, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal-spatial+changes+in+Sonic+Hedgehog+expression+and+signaling+reveal+different+potentials+of+ventral+mesencephalic+progenitors+to+populate+distinct+ventral+midbrain+nuclei.">Temporal-spatial changes in Sonic Hedgehog expression and signaling reveal different potentials of ventral mesencephalic progenitors to populate distinct ventral midbrain nuclei.</a> Neural. Dev. 6 (1), 29-29 (2011).</li><li>Hippenmeyer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling.">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biol. 3 (5), e159-e159 (2005).</li></ol>

La méthode organotypique culture présentées ici fournit un système pour le court terme dans l&#39;analyse in vitro des neurones dopaminergiques de développement et de leurs routes migratoires et de projection dans le mésencéphale embryonnaire ventrale. Nous avons trouvé qu&#39;il ya un certain nombre d&#39;étapes critiques dans le protocole qui doit être soignée afin d&#39;obtenir des tranches qui permettent le développement normal des neurones dopaminergiques du mésencéphale ventral. L&#39;étape...

Table des réactifs spécifiques et des équipements <table border="1"><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D6429 </td><td></td></tr><tr><td> Glucose 30% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7528-250 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de cheval </td><td> Invitrogen </td><td> 26050-088 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM (4,5 g / L Glc., Avec L-Gln, Na Pyr, NaHCO3) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D6429-500 </td><td></td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine 100x </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4333-20 </td><td></td></tr><tr><td> Acide L-ascorbique </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4403 </td><td> Préparez le bouillon 200mm et conserver à -20 ° C </td></tr><tr><td> UltraPure agarose LMP </td><td> Invitrogen </td><td> 15517-022 </td><td></td></tr><tr><td> Insère Millicel </td><td> Millipore </td><td> PICMORG50 </td><td></td></tr><tr><td> μ-plat de 35 mm, faible </td><td> Ibidi </td><td> 80136 </td><td></td></tr><tr><td> Vibratome </td><td> Microm </td><td> HM 650V </td><td></td></tr><tr><td> Lame de rasoir </td><td> Plano GmbH </td><td> 121-6 </td><td></td></tr><tr><td> Histoacryl colle </td><td> BRAU9381104 </td><td> Braun Aesculap </td><td></td></tr><tr><td> Dia cuillère perforée diamètre 15 mm </td><td> Outils Fine Science </td><td> 10370 -18 </td><td></td></tr><tr><td> Pince 5 Dumoxel </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11252-30 </td><td></td></tr></table> Anticorps utilisés pour immunomarquages: <table border="1"><tr><td&gt; Nom de l&#39;anticorps </td><td> Société </td><td > Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Lapin anti-tyrosine hydroxylase </td><td> Millipore </td><td> AB152 </td><td> Dilution 1:500 </td></tr><tr><td> Souris anti-tyrosine hydroxylase </td><td> Millipore </td><td> MAB318 </td><td> Dilution 1:500 </td></tr><tr><td> Souris anti-BrdU </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555627 </td><td> Dilution 1:200 </td></tr><tr><td> Lapin anti-caspase 3 clivée </td><td> Technologie signalisation cellulaire </td><td> 9661 </td><td> Dilution 1:200 </td></tr><tr><td> D&#39;âne anti-IgG de lapin-Alexa 488 </td><td> Invitrogen </td><td> A21206 </td><td> Dilution 1:500 </td></tr><tr><td> D&#39;âne anti-IgG de souris-Cy3 </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 715-165-150 </td><td> Dilution 1:200 </td></tr></table>

organotypic slice cultures of embryonic ventral midbrain: a system to study dopaminergic neuronal development in vitro

La souris est un organisme excellent modèle pour étudier le développement du cerveau des mammifères en raison de l&#39;abondance de données moléculaires et génétiques. Toutefois, le cerveau de souris en développement n&#39;est pas adapté pour la manipulation facile et d&#39;imagerie in vivo, depuis l&#39;embryon de souris est inaccessible et opaque. Cultures organotypique de cerveaux embryonnaires sont donc largement utilisées pour étudier le développement du cerveau murin in vitro. Ex-vivo la manipulation ou l&#39;utilisation de souris transgéniques permet la modification de l&#39;expression génique afin que les sous-populations de cellules neuronales ou gliales peuvent être étiquetés avec des protéines fluorescentes. Le comportement des cellules marquées peuvent alors être observés à l&#39;aide imagerie time-lapse. Time-lapse d&#39;imagerie a été particulièrement fructueuse pour l&#39;étude des comportements cellulaires qui sous-tendent le développement du cortex cérébral à la fin des stades embryonnaires 1-2. Embryonnaire des systèmes de culture organotypiques de tranches dans les régions du cerveau en dehors du cerveau antérieur sont establis moins bienhed. Par conséquent, la richesse des données d&#39;imagerie time-lapse décrivant la migration des cellules neuronales est limitée à 3,4 le prosencéphale. Il n&#39;est pas encore connu, si les principes découverts par le cerveau dorsale vrai pour les zones du cerveau ventral. Dans le cerveau ventrale, les neurones sont organisés en grappes neuronale plutôt que des couches et ils ont souvent à subir les trajectoires migratoires complexes pour atteindre leur position finale. Le mésencéphale ventral est non seulement un bon modèle pour le développement du cerveau ventral, mais contient aussi des populations neuronales comme les neurones dopaminergiques qui sont pertinentes dans les processus de la maladie. Alors que la fonction et la dégénérescence des neurones dopaminergiques a été étudiée en détail chez l&#39;adulte et le vieillissement du cerveau, on connaît peu le comportement de ces neurones au cours de leur différenciation et 5 phase de migration. Nous décrivons ici la génération des cultures tranche du jour embryonnaire (E) 12,5 mésencéphale ventral de la souris. Ces cultes trancheres sont potentiellement adaptés à la surveillance développement des neurones dopaminergiques sur plusieurs jours in vitro. Nous mettons en évidence les étapes critiques dans la génération des tranches de cerveau à ces stades précoces du développement embryonnaire et de discuter les conditions nécessaires pour maintenir un développement normal des neurones dopaminergiques in vitro. Nous avons également présenter les résultats des expériences d&#39;imagerie time lapse. Dans ces expériences, les précurseurs du mésencéphale ventral (y compris les précurseurs dopaminergiques) et leurs descendants ont été étiquetés de manière à l&#39;aide d&#39;une mosaïque de Cre / loxP système de cartographie basée sur le destin inductible 6.

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Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Une méthode pour générer des tranches organotypiques de l&#39;embryon murin E12.5 mésencéphale est décrite. Les cultures organotypique peut être utilisé pour observer le comportement des neurones dopaminergiques du mésencéphale ou d&#39;autres neurones ventraux.

Cultures organotypique de mésencéphale ventral embryonnaire: Un système pour étudier le développement neuronal dopaminergique In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

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