Name: organotypic slice cultures of embryonic ventral midbrain: a system to study dopaminergic neuronal development in vitro
Uploaded: 2012-01-31T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro at JoVE.com

Agradecemos a Martine Emond e Isabel Brachmann por sua ajuda no estabelecimento do sistema de cultura organotípicas fatia e Wolfgang Hübner e Liviu Gabriel Bodea para a leitura crítica do manuscrito. Gostaríamos de agradecer a Frank Costantini para o R26 ratos repórter e Cliff Tabin para os ratos creer Shh. Este estudo foi financiado por um Prêmio de Pesquisa do Ministério da Ciência e Investigação de North-Rhine Westphalia (Programm zur Förderung der Rückkehr des wissenschaftlichen Spitzennachwuchses aus dem Ausland).

Partes do presente protocolo são modificados a partir de Daza et al., 2007 7. 1. Preparativos <ol><li> Pode ser preparado um dia de antecedência <ol><li> Prepare 1X tampão Krebs (1,5 L): 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,2 mM NaH 2 PO 4: H 2 O, 1,2 mM MgCl 2, 2,5 mM CaCl 2, 11 mM de glucose, 25 mM NaHCO 3; ajustar o pH para 7,4. Filtro de esterilizar (0,22 tamanho dos poros mm) e armazenar ...

<ol>
	<li>Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases.">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nat. Neurosci. 7 (2), 136-136 (2004).</li><li>Martini, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biased+selection+of+leading+process+branches+mediates+chemotaxis+during+tangential+neuronal+migration.">Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration.</a> Development. 136 (1), 41-41 (2009).</li><li>Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guiding+neuronal+cell+migrations.">Guiding neuronal cell migrations.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2 (2), a001834-a001834 (2010).</li><li>Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trekking+across+the+brain:+the+journey+of+neuronal+migration.">Trekking across the brain: the journey of neuronal migration.</a> Cell. 128 (1), 29-29 (2007).</li><li>Smidt, M. P., Burbach, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+mesodiencephalic+dopaminergic+neuron.">How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron.</a> Nat. Rev. Neurosci. 8 (1), 21-21 (2007).</li><li>Legue, E., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+fate+mapping+using+site-specific+recombinases.">Genetic fate mapping using site-specific recombinases.</a> Methods. Enzymol. 477, 153-153 (2010).</li><li>Daza, R. A., Englund, C., Hevner, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+culture+of+embryonic+brain+tissue.">Organotypic slice culture of embryonic brain tissue.</a> CSH Protoc. , (2007).</li><li>Harfe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+an+expansion-based+temporal+Shh+gradient+in+specifying+vertebrate+digit+identities.">Evidence for an expansion-based temporal Shh gradient in specifying vertebrate digit identities.</a> Cell. 118 (4), 517-517 (2004).</li><li>Srinivas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus.">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Dev. Biol. 1, 4-4 (2001).</li><li>Joksimovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporally+separable+Shh+domains+in+the+midbrain+define+distinct+dopaminergic+progenitor+pools.">Spatiotemporally separable Shh domains in the midbrain define distinct dopaminergic progenitor pools.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (45), 19185-19185 (2009).</li><li>Blaess, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal-spatial+changes+in+Sonic+Hedgehog+expression+and+signaling+reveal+different+potentials+of+ventral+mesencephalic+progenitors+to+populate+distinct+ventral+midbrain+nuclei.">Temporal-spatial changes in Sonic Hedgehog expression and signaling reveal different potentials of ventral mesencephalic progenitors to populate distinct ventral midbrain nuclei.</a> Neural. Dev. 6 (1), 29-29 (2011).</li><li>Hippenmeyer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling.">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biol. 3 (5), e159-e159 (2005).</li></ol>

O método de cultura organotípicas fatia aqui apresentada fornece um sistema para o curto prazo in vitro de análise de desenvolvimento de neurônios dopaminérgicos e suas rotas migratórias e projeção no mesencéfalo ventral embrionárias. Descobrimos que há uma série de etapas críticas do protocolo que deve ser cuidadosamente atendidos, a fim de obter fatias que permitem o desenvolvimento normal dos neurônios do mesencéfalo ventral dopaminérgicos. O passo mais crítico é a dissecação do cérebro ...

Tabela de reagentes e equipamentos específicos <table border="1"><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comments (opcional) </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D6429 </td><td></td></tr><tr><td> Glicose 30% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7528-250 </td><td></td></tr><tr><td> Soro de cavalo </td><td> Invitrogen </td><td> 26050-088 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM (4,5 g / L Glc., Com L-Gln, Na Pyr, NaHCO3) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D6429-500 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina estreptomicina / 100x </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4333-20 </td><td></td></tr><tr><td> L-ácido ascórbico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4403 </td><td> preparar ações de 200mm e armazenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> UltraPure agarose LMP </td><td> Invitrogen </td><td> 15517-022 </td><td></td></tr><tr><td> Insere Millicel </td><td> Millipore </td><td> PICMORG50 </td><td></td></tr><tr><td> μ-prato de 35 mm, de baixa </td><td> Ibidi </td><td> 80136 </td><td></td></tr><tr><td> Vibratome </td><td> Microm </td><td> HM 650V </td><td></td></tr><tr><td> Gilete </td><td> Plano GmbH </td><td> 121-6 </td><td></td></tr><tr><td> Histoacryl cola </td><td> BRAU9381104 </td><td> Braun Aesculap </td><td></td></tr><tr><td> Dia Colher perfurada 15 mm de diâmetro </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 10370 -18 </td><td></td></tr><tr><td> Fórceps 5 Dumoxel </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 11252-30 </td><td></td></tr></table> Anticorpos utilizados para reações imunoistoquímicas: <table border="1"><tr><td&gt; Nome do anticorpo </td><td> Companhia </td><td > Número de catálogo </td><td> Comments (opcional) </td></tr><tr><td> Hidroxilase anti-tirosina coelho </td><td> Millipore </td><td> AB152 </td><td> Diluição 1:500 </td></tr><tr><td> Rato anti-tirosina hidroxilase </td><td> Millipore </td><td> MAB318 </td><td> Diluição 1:500 </td></tr><tr><td> Rato anti-BrdU </td><td> BD PharMingen </td><td> 555627 </td><td> Diluição 1:200 </td></tr><tr><td> De coelho anti-caspase 3 clivada </td><td> Tecnologia de sinalização celular </td><td> 9661 </td><td> Diluição 1:200 </td></tr><tr><td> Donkey anti-rabbit IgG-Alexa 488 </td><td> Invitrogen </td><td> A21206 </td><td> Diluição 1:500 </td></tr><tr><td> Donkey anti-mouse IgG-Cy3 </td><td> ImmunoResearch Jackson </td><td> 715-165-150 </td><td> Diluição 1:200 </td></tr></table>

organotypic slice cultures of embryonic ventral midbrain: a system to study dopaminergic neuronal development in vitro

O mouse é um organismo excelente modelo para estudar o desenvolvimento do cérebro dos mamíferos, devido à abundância de dados moleculares e genéticos. No entanto, o cérebro do rato em desenvolvimento não é adequado para fácil manipulação e de imagem in vivo desde o embrião de rato é inacessível e opaco. Culturas fatia organotípicas de cérebros embrionárias são, portanto, amplamente utilizada para estudar o desenvolvimento do cérebro de camundongos in vitro. Ex-vivo de manipulação ou o uso de camundongos transgênicos permite a modificação da expressão do gene para que subpopulações de células neuronais ou gliais podem ser rotulados com proteínas fluorescentes. O comportamento de células marcadas podem então ser observadas utilizando lapso de tempo de imagem. Lapso de tempo de imagem tem sido particularmente bem sucedido para estudar comportamentos de células que sustentam o desenvolvimento do córtex cerebral na tarde estágios embrionários 1-2. Embrionárias sistemas fatia organotípicas cultura em regiões do cérebro fora da parte frontal do cérebro são Establis menos bemhed. Portanto, a riqueza de dados time-lapse imagem descrevendo a migração celular neuronal é restrito a parte frontal do cérebro 3,4. Ainda não é conhecido, se os princípios descobertos para o cérebro dorsal são verdadeiras para áreas do cérebro ventral. Ventral do cérebro, os neurônios são organizados em grupos neuronal ao invés de camadas e muitas vezes eles têm que se submeter complicadas trajetórias migratórias para chegar a sua posição final. Mesencéfalo ventral não é apenas um sistema bom modelo para o desenvolvimento cerebral ventral, mas também contém populações neuronais tais como neurônios dopaminérgicos que são relevantes nos processos de doença. Enquanto a função e degeneração de neurônios dopaminérgicos tem sido investigada em grande detalhe no adulto e envelhecimento cerebral, pouco se sabe sobre o comportamento desses neurônios durante a sua diferenciação e fase de migração, 5. Descrevemos aqui a geração de culturas fatia do dia embrionário (E) do mesencéfalo ventral de rato 12,5. Estes cult fatiamentos são potencialmente adequado para o monitoramento do desenvolvimento dos neurônios dopaminérgicos durante vários dias in vitro. Destacam-se os passos críticos na geração de fatias do cérebro nesses estágios iniciais do desenvolvimento embrionário e discutir as condições necessárias para manter o desenvolvimento normal de neurônios dopaminérgicos in vitro. Também apresentam resultados de experimentos de tempo de imagem lapso. Nesses experimentos, mesencéfalo ventral de precursores (incluindo precursores dopaminérgicos) e seus descendentes foram rotulados de uma forma de mosaico usando um Cre / loxP baseada induzível sistema de mapeamento destino 6.

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Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Um método para gerar fatias organotípicas da E12.5 mesencéfalo embrionário murino é descrito. As culturas fatia organotípicas pode ser usado para observar o comportamento de neurônios dopaminérgicos ou outros neurônios do mesencéfalo ventral.

Organotípicas culturas de mesencéfalo ventral Slice Embrionárias: Um Sistema para o Estudo de Desenvolvimento Neuronal dopaminérgicos In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

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In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

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Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

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A identificação fiável de Vida neurônios dopaminérgicos em culturas mesencéfalo Usando RNA Sequenciamento e TH-driven-promotor eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...