Name: rnai screening to identify postembryonic phenotypes in c. elegans
Uploaded: 2012-02-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות ד&quot;ר ריק פאדג&#39;ט (וקסמן המכון, אוניברסיטת רוטגרס, ניו ג&#39;רזי) על המתנה של dbl-1 cDNA וד&quot;ר כריסטופר Rongo (מכון וקסמן, אוניברסיטת רוטגרס, ניו ג&#39;רזי) לסמן זריקה. המעבדה ד&quot;ר Barth של גרנט ביצעה את האקדח גן הפצצה לשילוב מספר נמוך עותק של מבנה ה-GFP-מתויג-1 dbl. גרסיה רנה המעבדה סיוע טכני במהלך היצירה של texIs100. גרסיה רנה, Lints רובין, ו Hongmin צ&#39;ין מעבדות סיפק ייעוץ פרודוקטיבי. עבודה זו מומנה על ידי הזנק קרנות מהמחלקה TAMHSC לרפואה מולקולרית תאית. היקף המתחם confocal דיסק מסתובב נרכשו במימון מחלקת ומכללת TAMHSC המשרד לרפואה של דין.

1. זן הקרנת הבנייה תכנון קפדני של זן ההקרנה היא קריטית להצלחה של המסך תוארה במקומות אחרים 3. עבור חוקרים מסוימים, באמצעות מאמץ המבטא מוצר גלוי מ transgene דרוש הניסוי. זנים רבים מחסה transgenes משולבים זמינים לחוקרים CGC או אדם פרטי. אם זן...

<ol>
	<li>Giacomotto, J., Segalat, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+and+small+animal+models,+where+are+we.">High-throughput screening and small animal models, where are we.</a> Br. J. Pharmacol. 160, 204-216 (2010).</li><li>Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+approaches+in+C.+elegans.">Functional genomic approaches in C. elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 351, 127-138 (2006).</li><li>Boutros, M., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+and+design+of+genetic+screens:+RNA+interference.">The art and design of genetic screens: RNA interference.</a> Nat. Rev. Genet. 9, 554-566 (2008).</li><li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans.">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157, 1217-1226 (2001).</li><li>Yandell, M. D., Edgar, L. G., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimethylpsoralen+induces+small+deletion+mutations+in+Caenorhabditis+elegans.">Trimethylpsoralen induces small deletion mutations in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 1381-1385 (1994).</li><li>Frokjaer-Jensen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-copy+insertion+of+transgenes+in+Caenorhabditis+elegans.">Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Genetics. 40, 1375-1383 (2008).</li><li>Giordano-Santini, R., Dupuy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectable+genetic+markers+for+nematode+transgenesis.">Selectable genetic markers for nematode transgenesis.</a> Cell. Mol. Life. Sci. , (2011).</li><li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Stable+Transgenic+C.+elegans+Using+Microinjection.">Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection.</a> J. Vis. Exp. (18), e833 (2008).</li><li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transformation.">DNA transformation.</a> Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).</li><li>Simmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+the+putative+RNA-directed+RNA+polymerase+RRF-3+makes+C.+elegans+hypersensitive+to+RNAi.">Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi.</a> Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).</li><li>Zhuang, J. J., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specificity+of+Caenorhabditis+elegans+enhanced+RNAi+mutants.">Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans enhanced RNAi mutants.</a> Genetics. , (2011).</li><li>Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Caenorhabditis+elegans+genes+regulating+longevity+using+enhanced+RNAi-sensitive+strains.">Identification of Caenorhabditis elegans genes regulating longevity using enhanced RNAi-sensitive strains.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 72, 489-497 (2007).</li><li>Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+misexpression+of+germline+P+granules+and+enhanced+RNA+interference+in+retinoblastoma+pathway+mutants.">Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants.</a> Nature. 436, 593-597 (2005).</li><li>Fraser, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+C.+elegans+chromosome+I+by+systematic+RNA+interference.">Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference.</a> Nature. 408, 325-330 (2000).</li><li>Kamath, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi.">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421, 231-237 (2003).</li><li>Peters, K., McDowall, J., Rose, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+bli-4+(I)+locus+of+Caenorhabditis+elegans+disrupt+both+adult+cuticle+and+early+larval+development.">Mutations in the bli-4 (I) locus of Caenorhabditis elegans disrupt both adult cuticle and early larval development.</a> Genetics. , 129-195 (1991).</li><li>Thacker, C., Peters, K., Srayko, M., Rose, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bli-4+locus+of+Caenorhabditis+elegans+encodes+structurally+distinct+kex2/subtilisin-like+endoproteases+essential+for+early+development+and+adult+morphology.">The bli-4 locus of Caenorhabditis elegans encodes structurally distinct kex2/subtilisin-like endoproteases essential for early development and adult morphology.</a> Genes &#38; Development. 9, 956-971 (1995).</li><li>Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life+cycle+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.+I.+Wild-type+growth+and+reproduction.">The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. I. Wild-type growth and reproduction.</a> Dev. Biol. 51, 23-33 (1976).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screen+for+small+body+size+mutants+in+C.+elegans+reveals+many+TGFbeta+pathway+components.">Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFbeta pathway components.</a> Genesis. 35, 239-247 (2003).</li><li>Qu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+analysis+of+the+Ahringer+Caenorhabditis+elegans+RNAi+feeding+library:+a+guide+for+genome-wide+screens.">Reliability analysis of the Ahringer Caenorhabditis elegans RNAi feeding library: a guide for genome-wide screens.</a> BMC Genomics. 12, 1471-2164 (2011).</li><li>Nelson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Bow-Tie+Genetic+Architecture+for+Morphogenesis+Suggested+by+a+Genome-Wide+RNAi+Screen+in+Caenorhabditis+elegans.">A Bow-Tie Genetic Architecture for Morphogenesis Suggested by a Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 7, e1002010 (2011).</li><li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+interference+by+ingested+dsRNA.">Specific interference by ingested dsRNA.</a> Nature. 395, 854 (1998).</li><li>Sarin, S., Prabhu, S., O'Meara, M. M., Pe'er, I., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+mutant+allele+identification+by+whole-genome+sequencing.">Caenorhabditis elegans mutant allele identification by whole-genome sequencing.</a> Nature Methods. 5, 865-867 (2008).</li><li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+culture+methods.">Basic culture methods.</a> Methods in Cell Biology. 48, 3-29 (1995).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li></ol>

שיטת ההקרנה RNAi המוצג כאן מאפשר ניתוח רגיש ומהיר של מוצרי גנים הנדרשים הפנוטיפ (או המהונדס) רגיל postembryonic. הדוגמה המוצגת היא המסך של גנים המעורבים בלוקליזציה subcellular של חלבון מתויג fluorescently. עם זאת, פרוטוקול זה יכול להיות שונה כדי לזהות את הגנים המשפיעים על פנוטיפים postembryoni...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> NGM אגר </td><td> הצמיחה נמטודות בינוני </td><td> IPM מדעי, Inc </td><td> ניתן להכין בעקבות פרוטוקול אגר NGM 25 </td></tr><tr><td> M9 בינוני </td><td> 22 מ&quot;מ KH 2 PO 4, 42 מ&quot;מ Na 2 HPO 4, 86mM NaCl, 1 mM MgSO 4 </td><td></td><td> 26 </td></tr><tr><td> אגר אגר, </td><td> EMD כימיקלים בע&quot;מ </td><td> 1.01614.1000 </td><td> 2% במים צלחות NGM. 4% במים רפידות שקופיות מיקרוסקופ (החיטוי בתחילה במיקרוגל כדי להמיס לאחר מכן). </td></tr><tr><td> Bacto Peptone </td><td> בקטון דיקינסון - Difco CP </td><td> 211677 </td><td> 0.25% </TD&gt; </tr><tr><td> IPTG </td><td> המחקר מוצרים אינטרנשיונל קורפ </td><td> I56000-5.0 </td><td> 1 הריכוז הסופי mM </td></tr><tr><td> carbenicillin </td><td> המחקר מוצרים אינטרנשיונל קורפ </td><td> C46000-5.0 </td><td> 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​דילול עובד </td></tr><tr><td> LB מרק לנוקס </td><td> בקטון דיקינסון - Difco CP </td><td> 240230 </td><td> 20 גר &#39;/ ליטר </td></tr><tr><td> טטרציקלין </td><td> סיגמא </td><td> 268054 </td><td> 12.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​דילול עובד </td></tr><tr><td> נתרן hypochlorite </td><td> כל מותג </td><td> בית 5% אקונומיקה </td><td> השתמש אקונומיקה טרי. </td></tr><tr><td> סודיום הידרוקסיד </td><td> כל מותג </td><td> CAS 1310-73-2 </td><td> 5 N המניות </td></tr><tr><td> M9 בינוני </td><td> Wormlab ספר המתכונים </td><td> <a href="http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab">http://1</a>30.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm # Commonlab </td><td> 26 </td></tr><tr><td> levamisol </td><td> סיגמא </td><td> 31742 </td><td> 100 מיקרומטר - 1 דילול עובד mM </td></tr><tr><td> אזיד הנתרן </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> S227 </td><td> 10 מ&quot;מ דילול עבודה M9 </td></tr><tr><td> 24 גם צלחת </td><td> גריינר Bio-One </td><td> 662160 </td><td> VWR מפיץ </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ שקופיות </td><td> כל מותג </td><td> 75 x 25 x 1 מ&quot;מ </td><td></td></tr><tr><td> כיסוי מיקרוסקופ תלושי </td><td> כל מותג </td><td> 22 x 22 מ&quot;מ No.1.5 </td><td> השתמש עובי המומלץ על ידי היצרן מיקרוסקופ. </td></tr><tr><td> תרכובת מיקרוסקופ </td><td> Carl Zeiss, Inc </td><td> A1m </td><td> השתמש יעדים ומסננים כדי להתאים את הצרכים של הניסוי. </td></tr><tr><td> התקשורת משאבת</td><td> Manostat משאבת Varistaltic </td><td> קייט המודל # 72-620-000 </td><td> השתמש בצינור ואת ההגדרות המתאימות למכשיר </td></tr></tbody></table>

rnai screening to identify postembryonic phenotypes in c. elegans

סי אלגנס הוכיחה להיות מערכת מודל ערך לגילוי ואפיון פונקציונלי של גנים רבים ושבילים גנים 1. כלים מתוחכמים יותר ומשאבים ללימודי במערכת זו יש להקל על הגילוי המתמשך של גנים עם פנוטיפים או תפקידים יותר עדינים. כאן אנו מציגים פרוטוקול כללית התאמנו לזיהוי ג elegans גנים עם פנוטיפים postembryonic בעלי עניין באמצעות RNAi 2. הליך זה שונה בקלות assay הפנוטיפ של בחירה, בין אם על ידי אופטיקה אור פלואורסצנטי או על מיקרוסקופ לנתח או תרכובת. זה פרוטוקול ההקרנה מנצל את הנכסים הפיזיים של האורגניזם וכלים מולקולריים ג הקהילה elegans המחקר הפיק. כדוגמה, אנחנו מדגימים את השימוש transgene משולבת המבטאת מוצר ניאון במסך RNAi לזהות גנים הנדרשים לוקליזציה רגיל לכךהמוצר הזחלים בשלב מאוחר ומבוגרים. ראשית, השתמשנו ספריה זמינים מסחרית RNAi גנומית עם באורך מלא מוסיף cDNA. ספריה זו מאפשרת זיהוי מהיר של מועמדים רבים על ידי הפחתת RNAi של המוצר הגן המועמד. שנית, אנו שנוצר transgene משולב המבטא חלבון מתויג fluorecently שלנו עניין ברקע RNAi רגיש. שלישית, על ידי חשיפת בעלי החיים בקעו כדי RNAi, מסך זה מאפשר זיהוי של מוצרים גנים שיש להם תפקיד חיוני עובריים שאחרת להסוות תפקיד שלאחר עובריים בוויסות חלבון של עניין. לבסוף, המסך הזה עושה שימוש במיקרוסקופ המתחם מצויד לפתרון תא בודד.

Watch this Scientific Journal Video about RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans at JoVE.com

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

אנו מתארים שיטה רגיש לזהות הרגולטורים postembryonic של ביטוי חלבונים לוקליזציה ב<em&gt; ג elegans</em&gt; באמצעות מסך RNAi מבוסס גנומית transgene משולב המבטא חלבון פונקציונלי, מתויג fluorescently.

RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב ג elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Research

JoVE Journal

Biology

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

הדור של Stable טראנסגנטי C. elegans שימוש Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

המשימה esiRNA עבור הקרנת RNAi בתאי יונקים

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

משלוח חיידקית של RNAi effectors: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

תפוקה גבוהה הקרנת ו biosensing עם פלורסנט ג elegans מתחים

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

כמותיים אוטומטי תפוקה גבוהה הגנום כולו RNAi המסכים ג elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

יצירת סביבות גזיים מוגדרים כדי לחקור את ההשפעות של היפוקסיה על<em&gt; ג elegans</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

Assay Chemotaxis סי אלגנס

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

נוגדן מכתים ב<em&gt; ג Elegans</em&gt; שימוש &quot;Freeze-פיצוח&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

מציאה גן בקנה מידה גדולה ב<em&gt; ג elegans</em&gt; שימוש בספריות האכלת dsRNA ליצור פנוטיפים הפסד של הפונקציה חזקות

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

דגם אנוקסיה רעב לאיסכמיה / reperfusion ב<em&gt; ג elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...