Name: rnai screening to identify postembryonic phenotypes in c. elegans
Uploaded: 2012-02-13T13:00:00
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著者らは、注射マーカーのDBL-1のcDNAとDrクリストファー·ロンゴ（ワクスマン研究所、ラトガース大学、ニュージャージー州）の贈り物に博士リックパジェット（ワクスマン研究所、ラトガース大学、ニュージャージー州）に感謝したいと思います。博士バルトグラントの研究室は、GFPタグ付きDBL-1コンストラクトの低コピー数の統合のための遺伝子銃砲撃を行った。ルネ·ガルシア研究室では、texIs100の作成 ​​中に技術支援を提供しました。ルネ·ガルシア、ロビンのLints、とHongmin秦研究所では、生産的なアドバイスを提供しました。この作品は、分子細胞医学のTAMHSC部からの起動資金によって賄われていた。化合物の範囲とスピニングディスク共焦点顕微鏡は、部門とディーン医学事務所のTAMHSC大学によって提供された資金で購入しました。

1。スクリーニング株の構築スクリーニング株の慎重なデザインは、画面を成功させるために重要であり、他の3に記載されている。一部の研究者については、導入遺伝子から見える産物を発現する菌株を使用することは実験のために必要とされる。統合された導入遺伝子を保有する多くの菌株は、CGCまたは個々の研究者から入手することができます。トランスジェ...

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	<li>Giacomotto, J., Segalat, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+and+small+animal+models,+where+are+we.">High-throughput screening and small animal models, where are we.</a> Br. J. Pharmacol. 160, 204-216 (2010).</li><li>Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+approaches+in+C.+elegans.">Functional genomic approaches in C. elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 351, 127-138 (2006).</li><li>Boutros, M., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+and+design+of+genetic+screens:+RNA+interference.">The art and design of genetic screens: RNA interference.</a> Nat. Rev. Genet. 9, 554-566 (2008).</li><li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans.">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157, 1217-1226 (2001).</li><li>Yandell, M. D., Edgar, L. G., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimethylpsoralen+induces+small+deletion+mutations+in+Caenorhabditis+elegans.">Trimethylpsoralen induces small deletion mutations in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 1381-1385 (1994).</li><li>Frokjaer-Jensen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-copy+insertion+of+transgenes+in+Caenorhabditis+elegans.">Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Genetics. 40, 1375-1383 (2008).</li><li>Giordano-Santini, R., Dupuy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectable+genetic+markers+for+nematode+transgenesis.">Selectable genetic markers for nematode transgenesis.</a> Cell. Mol. Life. Sci. , (2011).</li><li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Stable+Transgenic+C.+elegans+Using+Microinjection.">Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection.</a> J. Vis. Exp. (18), e833 (2008).</li><li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transformation.">DNA transformation.</a> Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).</li><li>Simmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+the+putative+RNA-directed+RNA+polymerase+RRF-3+makes+C.+elegans+hypersensitive+to+RNAi.">Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi.</a> Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).</li><li>Zhuang, J. J., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specificity+of+Caenorhabditis+elegans+enhanced+RNAi+mutants.">Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans enhanced RNAi mutants.</a> Genetics. , (2011).</li><li>Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Caenorhabditis+elegans+genes+regulating+longevity+using+enhanced+RNAi-sensitive+strains.">Identification of Caenorhabditis elegans genes regulating longevity using enhanced RNAi-sensitive strains.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 72, 489-497 (2007).</li><li>Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+misexpression+of+germline+P+granules+and+enhanced+RNA+interference+in+retinoblastoma+pathway+mutants.">Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants.</a> Nature. 436, 593-597 (2005).</li><li>Fraser, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+C.+elegans+chromosome+I+by+systematic+RNA+interference.">Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference.</a> Nature. 408, 325-330 (2000).</li><li>Kamath, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi.">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421, 231-237 (2003).</li><li>Peters, K., McDowall, J., Rose, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+bli-4+(I)+locus+of+Caenorhabditis+elegans+disrupt+both+adult+cuticle+and+early+larval+development.">Mutations in the bli-4 (I) locus of Caenorhabditis elegans disrupt both adult cuticle and early larval development.</a> Genetics. , 129-195 (1991).</li><li>Thacker, C., Peters, K., Srayko, M., Rose, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bli-4+locus+of+Caenorhabditis+elegans+encodes+structurally+distinct+kex2/subtilisin-like+endoproteases+essential+for+early+development+and+adult+morphology.">The bli-4 locus of Caenorhabditis elegans encodes structurally distinct kex2/subtilisin-like endoproteases essential for early development and adult morphology.</a> Genes &#38; Development. 9, 956-971 (1995).</li><li>Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life+cycle+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.+I.+Wild-type+growth+and+reproduction.">The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. I. Wild-type growth and reproduction.</a> Dev. Biol. 51, 23-33 (1976).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screen+for+small+body+size+mutants+in+C.+elegans+reveals+many+TGFbeta+pathway+components.">Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFbeta pathway components.</a> Genesis. 35, 239-247 (2003).</li><li>Qu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+analysis+of+the+Ahringer+Caenorhabditis+elegans+RNAi+feeding+library:+a+guide+for+genome-wide+screens.">Reliability analysis of the Ahringer Caenorhabditis elegans RNAi feeding library: a guide for genome-wide screens.</a> BMC Genomics. 12, 1471-2164 (2011).</li><li>Nelson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Bow-Tie+Genetic+Architecture+for+Morphogenesis+Suggested+by+a+Genome-Wide+RNAi+Screen+in+Caenorhabditis+elegans.">A Bow-Tie Genetic Architecture for Morphogenesis Suggested by a Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 7, e1002010 (2011).</li><li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+interference+by+ingested+dsRNA.">Specific interference by ingested dsRNA.</a> Nature. 395, 854 (1998).</li><li>Sarin, S., Prabhu, S., O'Meara, M. M., Pe'er, I., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+mutant+allele+identification+by+whole-genome+sequencing.">Caenorhabditis elegans mutant allele identification by whole-genome sequencing.</a> Nature Methods. 5, 865-867 (2008).</li><li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+culture+methods.">Basic culture methods.</a> Methods in Cell Biology. 48, 3-29 (1995).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li></ol>

ここで紹介するRNAiスクリーニング方法は、通常の（トランスジェニック）後胚表現型に必要な遺伝子産物の高感度で迅速な分析を可能にします。に示す例では、蛍光標識タンパク質の細胞内局在性に関与する遺伝子の画面です。しかし、このプロトコルは、関心のある他の後胚の表現型に影響を及ぼす遺伝子を同定するために変更することができます。 このメソッドは?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> NGM寒天培地</td><td>線虫の増殖培地</td><td> IPMサイエンティフィック株式会社</td><td> NGM寒天プロトコル25に従って調製することができます</td></tr><tr><td> M9培地</td><td> 22mmのKH 2 PO 4、 42MMのNa 2 HPO 4、 86mMのNaCl、 1 mMのMgSO 4を </td><td></td><td> 26 </td></tr><tr><td>寒天</td><td> EMDケミカルズ</td><td> 1.01614.1000 </td><td> NGMプレートの水に2％であった。顕微鏡スライドパッドの水に4％（当初は、その後、溶融するためのマイクロオートクレーブ）。 </td></tr><tr><td>バクトペプトン</td><td>ベクトン·ディキンソン - Difco社製CP </td><td> 211677 </td><td> 0.25パーセント</TD&gt; </tr><tr><td> IPTG </td><td>研究プロダクツ国際社</td><td> I56000-5.0 </td><td> 1mMの最終濃度</td></tr><tr><td>カルベニシリン</td><td>研究プロダクツ国際社</td><td> C46000-5.0 </td><td> 50μg/ mlの希釈率</td></tr><tr><td> LBブロスレノックス</td><td>ベクトン·ディキンソン - Difco社製CP </td><td> 240230 </td><td> 20グラム/リットル</td></tr><tr><td>テトラサイクリン</td><td>シグマ</td><td> 268054 </td><td> 12.5μg/ mlの希釈率</td></tr><tr><td>次亜塩素酸ナトリウム</td><td>すべてのブランド</td><td> 5％の家庭用漂白剤</td><td>新鮮な漂白剤を使用しています。 </td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>すべてのブランド</td><td> CAS 1310-73-2 </td><td> 5 Nの在庫</td></tr><tr><td> M9培地</td><td> Wormlabレシピブック</td><td> <a href="http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab">http://1</a>30.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm＃Commonlab </td><td> 26 </td></tr><tr><td> levamisol </td><td>シグマ</td><td> 31742 </td><td> 100μM - 1mMの希釈率</td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> S227 </td><td> M9の作業希釈で、10mMの</td></tr><tr><td> 24ウェルプレート</td><td>グライナーバイオワン</td><td> 662160 </td><td> VWR販売代理店</td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>すべてのブランド</td><td> 75×25×1ミリメートル</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡カバースリップ</td><td>すべてのブランド</td><td> 22×22ミリメートルNo.1.5 </td><td>顕微鏡メーカーが推奨する厚さを使用しています。 </td></tr><tr><td>複合顕微鏡</td><td>カールツァイス株式会社</td><td> A1m </td><td>実験のニーズに合わせて目標やフィルタを使用しています。 </td></tr><tr><td>メディア·ポンプ</td><td>マノスタットVaristalticポンプ</td><td>ケイト モデル＃72-620-000 </td><td>チューブとマシンの適切な設定を使用</td></tr></tbody></table>

rnai screening to identify postembryonic phenotypes in c. elegans

線虫C. elegansは、多くの遺伝子や遺伝子経路1の発見と機能解析のための貴重なモデルシステムであることが判明した。このシステムでは、研究のためのより洗練されたツールやリソースは、より微妙な表現型またはロールを持つ遺伝子の継続的な発見を容易にしています。 ここで我々はCを識別するための適応一般的なプロトコルを提示RNAiの2を使用して関心の後胚の表現型を有する線虫の遺伝子。この手順は、簡単にかどうかを解剖または化合物を顕微鏡の光や蛍光光学系により、アッセイの選択肢の表現に変更されます。このスクリーニングのプロトコルは、生物の物理的な資産および分子ツールにCを大文字にelegansの研究コミュニティが生産している。例として、我々は、この通常のローカライズに必要な遺伝子を識別するために、RNAiスクリーニングの蛍光産物を発現する統合されたトランスジーンの使用方法を示してい後期幼虫と成虫の製品。まず、完全長cDNAインサートを市販のゲノムRNAiライブラリーを使用していました。このライブラリは、候補遺伝子産物のRNAi還元することにより複数の候補の迅速な同定を容易にします。第二に、我々はRNAiと小文字を区別し、バックグラウンドで興味のある私たちのfluorecentlyタグ付きタンパク質を発現する統合された導入遺伝子を生成します。第三に、RNAi実験に孵化した動物を曝すことによって、この画面では、そうでなければ、目的のタンパク質を調節するのに後胚の役割をマスクしたい重要な胚の役割を担っている遺伝子産物の同定を可能にします。最後に、この画面では、単一細胞の解像度のために装備の複合顕微鏡を使用しています。

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RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

我々は、タンパク質の発現と局在の後胚レギュレータを識別するための増感方法について説明します。<em&gt; C.エレガンス</em&gt; RNAiベースゲノムの画面と機能的な、蛍光標識タンパク質を発現する統合された遺伝子を使用します。

の後胚表現型を識別するためのRNAiスクリーニング C.エレガンス</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Research

JoVE Journal

Biology

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

マイクロインジェクションを使用して安定したトランスジェニック線虫の世代

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

哺乳動物細胞におけるRNAiスクリーニングのためのミッションesiRNA

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

RNAiのエフェクターの細菌配達：Transkingdom RNAiの

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

蛍光とハイスループットスクリーニングとバイオセンシング C.エレガンス菌株

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

の定量と自動ハイスループットゲノムワイドRNAiスクリーニング C.エレガンス</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

に低酸素の影響を検討するために定義され気体環境を作成する<em&gt; C.エレガンス</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegansの走化性アッセイ

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

抗体染色中<em&gt; C.虫</em&gt;「フリーズクラッキング」使用

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

大規模な遺伝子ノックダウン中<em&gt; C.虫</em&gt;堅牢な機能喪失表現型を生成するためのdsRNA摂食ライブラリの使用

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

における虚血/再灌流のための無酸素飢餓モデル<em&gt; C.虫</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...