Name: rnai screening to identify postembryonic phenotypes in c. elegans
Uploaded: 2012-02-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить д-р Рик Паджетт (Ваксман институт, Rutgers University, Нью-Джерси) за дар DBL-1 кДНК и д-р Кристофер ронго (Ваксман институт, Rutgers University, Нью-Джерси) для инъекций маркера. Лаборатории доктора Барта Гранта осуществляется бомбардировка генной пушки низкой интеграции номер копии GFP с метками DBL-1 конструкции. Рене Гарсиа лаборатория оказала техническую помощь в процессе создания texIs100. Рене Гарсиа, Робин Lints и Hongmin Цинь лабораторий, продуктивный совет. Эта работа финансировалась запуска средства TAMHSC Отдел молекулярной и клеточной медицины. Область соединения и вращается диск конфокальной было приобретено на средства, предоставленные отделом и TAMHSC Медицинского колледжа Деканат.

1. Строительство Скрининг деформации Тщательной разработки скрининга штамм имеет решающее значение для успеха на экране и была описана в другом месте 3. Для некоторых исследователей, используя штамм, который выражает видимый продукт от трансгенов необходимо для эк...

<ol>
	<li>Giacomotto, J., Segalat, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+and+small+animal+models,+where+are+we.">High-throughput screening and small animal models, where are we.</a> Br. J. Pharmacol. 160, 204-216 (2010).</li><li>Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+approaches+in+C.+elegans.">Functional genomic approaches in C. elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 351, 127-138 (2006).</li><li>Boutros, M., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+and+design+of+genetic+screens:+RNA+interference.">The art and design of genetic screens: RNA interference.</a> Nat. Rev. Genet. 9, 554-566 (2008).</li><li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans.">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157, 1217-1226 (2001).</li><li>Yandell, M. D., Edgar, L. G., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimethylpsoralen+induces+small+deletion+mutations+in+Caenorhabditis+elegans.">Trimethylpsoralen induces small deletion mutations in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 1381-1385 (1994).</li><li>Frokjaer-Jensen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-copy+insertion+of+transgenes+in+Caenorhabditis+elegans.">Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Genetics. 40, 1375-1383 (2008).</li><li>Giordano-Santini, R., Dupuy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectable+genetic+markers+for+nematode+transgenesis.">Selectable genetic markers for nematode transgenesis.</a> Cell. Mol. Life. Sci. , (2011).</li><li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Stable+Transgenic+C.+elegans+Using+Microinjection.">Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection.</a> J. Vis. Exp. (18), e833 (2008).</li><li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transformation.">DNA transformation.</a> Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).</li><li>Simmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+the+putative+RNA-directed+RNA+polymerase+RRF-3+makes+C.+elegans+hypersensitive+to+RNAi.">Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi.</a> Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).</li><li>Zhuang, J. J., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specificity+of+Caenorhabditis+elegans+enhanced+RNAi+mutants.">Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans enhanced RNAi mutants.</a> Genetics. , (2011).</li><li>Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Caenorhabditis+elegans+genes+regulating+longevity+using+enhanced+RNAi-sensitive+strains.">Identification of Caenorhabditis elegans genes regulating longevity using enhanced RNAi-sensitive strains.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 72, 489-497 (2007).</li><li>Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+misexpression+of+germline+P+granules+and+enhanced+RNA+interference+in+retinoblastoma+pathway+mutants.">Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants.</a> Nature. 436, 593-597 (2005).</li><li>Fraser, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+C.+elegans+chromosome+I+by+systematic+RNA+interference.">Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference.</a> Nature. 408, 325-330 (2000).</li><li>Kamath, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi.">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421, 231-237 (2003).</li><li>Peters, K., McDowall, J., Rose, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+bli-4+(I)+locus+of+Caenorhabditis+elegans+disrupt+both+adult+cuticle+and+early+larval+development.">Mutations in the bli-4 (I) locus of Caenorhabditis elegans disrupt both adult cuticle and early larval development.</a> Genetics. , 129-195 (1991).</li><li>Thacker, C., Peters, K., Srayko, M., Rose, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bli-4+locus+of+Caenorhabditis+elegans+encodes+structurally+distinct+kex2/subtilisin-like+endoproteases+essential+for+early+development+and+adult+morphology.">The bli-4 locus of Caenorhabditis elegans encodes structurally distinct kex2/subtilisin-like endoproteases essential for early development and adult morphology.</a> Genes &#38; Development. 9, 956-971 (1995).</li><li>Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life+cycle+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.+I.+Wild-type+growth+and+reproduction.">The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. I. Wild-type growth and reproduction.</a> Dev. Biol. 51, 23-33 (1976).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screen+for+small+body+size+mutants+in+C.+elegans+reveals+many+TGFbeta+pathway+components.">Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFbeta pathway components.</a> Genesis. 35, 239-247 (2003).</li><li>Qu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+analysis+of+the+Ahringer+Caenorhabditis+elegans+RNAi+feeding+library:+a+guide+for+genome-wide+screens.">Reliability analysis of the Ahringer Caenorhabditis elegans RNAi feeding library: a guide for genome-wide screens.</a> BMC Genomics. 12, 1471-2164 (2011).</li><li>Nelson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Bow-Tie+Genetic+Architecture+for+Morphogenesis+Suggested+by+a+Genome-Wide+RNAi+Screen+in+Caenorhabditis+elegans.">A Bow-Tie Genetic Architecture for Morphogenesis Suggested by a Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 7, e1002010 (2011).</li><li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+interference+by+ingested+dsRNA.">Specific interference by ingested dsRNA.</a> Nature. 395, 854 (1998).</li><li>Sarin, S., Prabhu, S., O'Meara, M. M., Pe'er, I., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+mutant+allele+identification+by+whole-genome+sequencing.">Caenorhabditis elegans mutant allele identification by whole-genome sequencing.</a> Nature Methods. 5, 865-867 (2008).</li><li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+culture+methods.">Basic culture methods.</a> Methods in Cell Biology. 48, 3-29 (1995).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li></ol>

Метод РНК-интерференции скрининга представленные здесь позволяет чувствительный и быстрый анализ генных продуктов, необходимых для нормальной (или трансгенных) постэмбрионального фенотипа. Пример приведен экран для генов, вовлеченных в субклеточные локализации флуоресцентной мече...

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td> NGM Агар </td><td> Нематоды среднего роста </td><td> ИПМ Научные, Inc </td><td> Может быть подготовлен NGM агар протокол 25 </td></tr><tr><td> M9 среднего </td><td> 22мм KH 2 PO 4, 42мм Na 2 HPO 4, 86 мм NaCl, 1 мМ MgSO 4 </td><td></td><td> 26 </td></tr><tr><td> Агар-агар </td><td> EMD химических Инк </td><td> 1.01614.1000 </td><td> 2% в воде NGM пластин. 4% в воде для прокладки стекло микроскопа (автоклав изначально и микроволновую печь, чтобы растопить в дальнейшем). </td></tr><tr><td> Bacto Пептон </td><td> Becton Dickinson - Difco CP </td><td> 211677 </td><td> 0,25% </TD&gt; </tr><tr><td> ИПТГ </td><td> Исследования продукции международной корпорации </td><td> I56000-5.0 </td><td> 1 мМ конечной концентрации </td></tr><tr><td> карбенициллин </td><td> Исследования продукции международной корпорации </td><td> C46000-5.0 </td><td> 50 мкг / мл рабочего разведения </td></tr><tr><td> LB бульоне Леннокс </td><td> Becton Dickinson - Difco CP </td><td> 240230 </td><td> 20 г / л </td></tr><tr><td> тетрациклин </td><td> Сигма </td><td> 268054 </td><td> 12,5 мкг / мл рабочего разведения </td></tr><tr><td> гипохлорита натрия </td><td> Любой бренд </td><td> 5% отбеливателя </td><td> Используйте свежие отбеливателя. </td></tr><tr><td> едкий натр </td><td> Любая марка </td><td> CAS 1310-73-2 </td><td> 5 N акции </td></tr><tr><td> M9 среда </td><td> Wormlab рецептов </td><td> <a href="http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab">http://1</a>30.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm # Commonlab </td><td> 26 </td></tr><tr><td> левамизола </td><td> Сигма </td><td> 31742 </td><td> 100 мкм - 1 мм Рабочее разведение </td></tr><tr><td> азид натрия </td><td> Fisher Scientific </td><td> S227 </td><td> 10 мм в рабочем разведении M9 </td></tr><tr><td> 24-луночного планшета </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 662160 </td><td> VWR дистрибьютора </td></tr><tr><td> предметные стекла </td><td> Любой бренд </td><td> 75 х 25 х 1 мм </td><td></td></tr><tr><td> скользит микроскоп крышкой </td><td> Любой бренд </td><td> 22 х 22 мм No.1.5 </td><td> Используйте толщиной рекомендованные производителем микроскопа. </td></tr><tr><td> сложный микроскоп </td><td> Carl Zeiss, Inc </td><td> A1M </td><td> Используйте цели и фильтры, чтобы соответствовать потребностям эксперимента. </td></tr><tr><td> СМИ насоса</td><td> Маностатом Varistaltic насоса </td><td> Кейт модель № 72-620-000 </td><td> Использование труб и настройки подходят для машин </td></tr></tbody></table>

rnai screening to identify postembryonic phenotypes in c. elegans

C. Элеганс оказалась ценной моделью системы для обнаружения и функциональные характеристики многих генов и генных пути 1. Более сложные инструменты и ресурсы для проведения исследований в этой системе, способствуют дальнейшей открытие генов с более тонким фенотип или ролей. Здесь мы приводим обобщенный протокол мы адаптировали для выявления C. Элеганс генов постэмбрионального фенотипы интерес использование RNAi 2. Эта процедура легко модифицируется для анализа фенотипа выбор, будь то свет или флуоресценции оптики на вскрытии или составной микроскоп. Этот протокол обследования капитализирует на физические активы организма и молекулярные инструменты C. Элеганс научное сообщество произвел. В качестве примера мы демонстрируем использование интегрированных трансгена, что выражает флуоресцентного продукта в экран RNAi, чтобы идентифицировать гены, необходимые для нормальной локализации этогоПродукт в конце стадии личинки и взрослые. Во-первых, мы использовали коммерчески доступный геномный RNAi библиотека с полной кДНК вставки. Эта библиотека обеспечивает быструю идентификацию нескольких кандидатов RNAi снижение продукт гена кандидата. Во-вторых, мы получили интегрированную трансгена, что выражает наше fluorecently меченый белок в РНК-интерференции с учетом фона. В-третьих, подвергая вылупившихся животных РНК-интерференции, этот экран позволяет идентифицировать генные продукты, которые играют жизненно важную роль эмбриональные, которые могли бы скрыть постэмбрионального роль в регуляции белков, представляющих интерес. Наконец, этот экран используется сложный микроскоп оборудован для одной резолюции клетки.

Watch this Scientific Journal Video about RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans at JoVE.com

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

Мы описываем чувствительный метод для выявления постэмбрионального регуляторов экспрессии белка и локализации<em&gt; С. Элеганс</em&gt; С помощью РНК-интерференции на основе геномных экран и встроенный трансгена, что выражает функциональный, помеченный флуоресцентной белка.

RNAi скрининга для выявления Постэмбриональное фенотипы в С. Элеганс</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Research

JoVE Journal

Biology

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Генерация Стабильный Трансгенные Элеганс C. Использование Микроинъекция

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

МИССИЯ esiRNA для скрининга RNAi в клетках млекопитающих

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

Бактериальные Доставка RNAi создания эффектов: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

Высокопроизводительный скрининг и биодатчиков с люминесцентными С. Элеганс Штаммы

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Количественные и автоматизированных высокой пропускной генома RNAi экраны в С. Элеганс</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Создание определяемых газообразных сред для изучения влияния гипоксии на<em&gt; С. Элеганс</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

C. Элеганс Анализ хемотаксиса

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Антитела Окрашивание в<em&gt; С. Элеганс</em&gt; Использование &quot;Freeze-Крекинг&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

Крупномасштабная Нокдаун гена в<em&gt; С. Элеганс</em&gt; Использование дцРНК кормления библиотек для генерации Прочные с потерей функции фенотипов

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Аноксия-голодание модель ишемии / реперфузии в<em&gt; С. Элеганс</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...