Name: rnai screening to identify postembryonic phenotypes in c. elegans
Uploaded: 2012-02-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans at JoVE.com

Författarna vill tacka Dr Rick Padgett (Waksman Institute, Rutgers University, NJ) för gåva dbl-1 cDNA och Dr Christopher Rongo (Waksman Institute, Rutgers University, NJ) för en injektion markör. Dr Barth Grant labb utförde bombningarna genkanonen för låg antal kopior integrering av GFP-märkta dbl-1-konstruktionen. Den René Garcia laboratoriet lämnat tekniskt bistånd under skapandet av texIs100. Den René Garcia, Robyn fluffmaterial och Hongmin Qin laboratorier som produktivt råd. Detta arbete har finansierats av nystartade medel från TAMHSC Institutionen för molekylär och cellulär medicin. Föreningen omfattning och spinning disk konfokala köptes med medel från institutionen och TAMHSC College of Medicine kontor dekanus.

1. Screening stamkonstruktion Den noggrann utformning av genomgången stam är kritisk för framgången av skärmen och har beskrivits på annat håll 3. För vissa forskare, är användning av en stam som uttrycker en synlig produkt från en transgen som behövs för experimentet. Många stammar som härbärgerar integrerade transgener är tillgängliga från CGC eller individuella forskare. Om ett transgent stam krävs för skärmen, men inte är tillgänglig, då den kan generera...

<ol>
	<li>Giacomotto, J., Segalat, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+and+small+animal+models,+where+are+we.">High-throughput screening and small animal models, where are we.</a> Br. J. Pharmacol. 160, 204-216 (2010).</li><li>Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+approaches+in+C.+elegans.">Functional genomic approaches in C. elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 351, 127-138 (2006).</li><li>Boutros, M., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+and+design+of+genetic+screens:+RNA+interference.">The art and design of genetic screens: RNA interference.</a> Nat. Rev. Genet. 9, 554-566 (2008).</li><li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans.">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157, 1217-1226 (2001).</li><li>Yandell, M. D., Edgar, L. G., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimethylpsoralen+induces+small+deletion+mutations+in+Caenorhabditis+elegans.">Trimethylpsoralen induces small deletion mutations in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 1381-1385 (1994).</li><li>Frokjaer-Jensen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-copy+insertion+of+transgenes+in+Caenorhabditis+elegans.">Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Genetics. 40, 1375-1383 (2008).</li><li>Giordano-Santini, R., Dupuy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectable+genetic+markers+for+nematode+transgenesis.">Selectable genetic markers for nematode transgenesis.</a> Cell. Mol. Life. Sci. , (2011).</li><li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Stable+Transgenic+C.+elegans+Using+Microinjection.">Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection.</a> J. Vis. Exp. (18), e833 (2008).</li><li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transformation.">DNA transformation.</a> Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).</li><li>Simmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+the+putative+RNA-directed+RNA+polymerase+RRF-3+makes+C.+elegans+hypersensitive+to+RNAi.">Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi.</a> Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).</li><li>Zhuang, J. J., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specificity+of+Caenorhabditis+elegans+enhanced+RNAi+mutants.">Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans enhanced RNAi mutants.</a> Genetics. , (2011).</li><li>Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Caenorhabditis+elegans+genes+regulating+longevity+using+enhanced+RNAi-sensitive+strains.">Identification of Caenorhabditis elegans genes regulating longevity using enhanced RNAi-sensitive strains.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 72, 489-497 (2007).</li><li>Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+misexpression+of+germline+P+granules+and+enhanced+RNA+interference+in+retinoblastoma+pathway+mutants.">Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants.</a> Nature. 436, 593-597 (2005).</li><li>Fraser, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+C.+elegans+chromosome+I+by+systematic+RNA+interference.">Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference.</a> Nature. 408, 325-330 (2000).</li><li>Kamath, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi.">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421, 231-237 (2003).</li><li>Peters, K., McDowall, J., Rose, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+bli-4+(I)+locus+of+Caenorhabditis+elegans+disrupt+both+adult+cuticle+and+early+larval+development.">Mutations in the bli-4 (I) locus of Caenorhabditis elegans disrupt both adult cuticle and early larval development.</a> Genetics. , 129-195 (1991).</li><li>Thacker, C., Peters, K., Srayko, M., Rose, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bli-4+locus+of+Caenorhabditis+elegans+encodes+structurally+distinct+kex2/subtilisin-like+endoproteases+essential+for+early+development+and+adult+morphology.">The bli-4 locus of Caenorhabditis elegans encodes structurally distinct kex2/subtilisin-like endoproteases essential for early development and adult morphology.</a> Genes &#38; Development. 9, 956-971 (1995).</li><li>Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life+cycle+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.+I.+Wild-type+growth+and+reproduction.">The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. I. Wild-type growth and reproduction.</a> Dev. Biol. 51, 23-33 (1976).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screen+for+small+body+size+mutants+in+C.+elegans+reveals+many+TGFbeta+pathway+components.">Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFbeta pathway components.</a> Genesis. 35, 239-247 (2003).</li><li>Qu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+analysis+of+the+Ahringer+Caenorhabditis+elegans+RNAi+feeding+library:+a+guide+for+genome-wide+screens.">Reliability analysis of the Ahringer Caenorhabditis elegans RNAi feeding library: a guide for genome-wide screens.</a> BMC Genomics. 12, 1471-2164 (2011).</li><li>Nelson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Bow-Tie+Genetic+Architecture+for+Morphogenesis+Suggested+by+a+Genome-Wide+RNAi+Screen+in+Caenorhabditis+elegans.">A Bow-Tie Genetic Architecture for Morphogenesis Suggested by a Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 7, e1002010 (2011).</li><li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+interference+by+ingested+dsRNA.">Specific interference by ingested dsRNA.</a> Nature. 395, 854 (1998).</li><li>Sarin, S., Prabhu, S., O'Meara, M. M., Pe'er, I., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+mutant+allele+identification+by+whole-genome+sequencing.">Caenorhabditis elegans mutant allele identification by whole-genome sequencing.</a> Nature Methods. 5, 865-867 (2008).</li><li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+culture+methods.">Basic culture methods.</a> Methods in Cell Biology. 48, 3-29 (1995).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li></ol>

Den RNAi screening metod som presenteras här ger en känslig och snabb analys av genprodukter som krävs för en normal (eller transgena) postembryonic fenotyp. Det visade exemplet är en skärm för gener som är involverade i den subcellulära lokaliseringen av en fluorescensmärkt märkt protein. Emellertid kan detta protokoll ändras för att identifiera gener som påverkar andra postembryonic fenotyper av intresse. Denna metod utnyttjar en kandidat gen strategi med hjälp av en RNAi bi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet på reagens </td><td> Företaget </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> NGM agar </td><td> Nematod tillväxtmedium </td><td> IPM Scientific, Inc </td><td> Kan framställas enligt NGM agar protokoll 25 </td></tr><tr><td> M9-medium </td><td> 22 mM KH 2 PO 4, 42mm Na 2 HPO 4, 86 mm NaCl, 1 mM MgSO 4 </td><td></td><td> 26 </td></tr><tr><td> Agar-agar </td><td> EMD Chemicals Inc. </td><td> 1.01614.1000 </td><td> 2% i vatten för NGM plattor. 4% i vatten för dynor objektglas (autoklaveras initialt och mikrovågsugn för att smälta därefter). </td></tr><tr><td> Bacto Peptone </td><td> Becton Dickinson - Difco CP </td><td> 211.677 </td><td> 0,25% </TD&gt; </tr><tr><td> IPTG </td><td> Forskning Products International Corp </td><td> I56000-5,0 </td><td> 1 mM slutlig koncentration </td></tr><tr><td> karbenicillin </td><td> Research Products International Corp </td><td> C46000-5,0 </td><td> 50 | ig / ml bruksspädning </td></tr><tr><td> LB buljong Lennox </td><td> Becton Dickinson - Difco CP </td><td> 240.230 </td><td> 20 g / liter </td></tr><tr><td> tetracyklin </td><td> Sigma </td><td> 268.054 </td><td> 12,5 pg / ml bruksspädning </td></tr><tr><td> natriumhypoklorit </td><td> Alla märken </td><td> 5% hushållsblekmedel </td><td> Använd färska blekmedel. </td></tr><tr><td> natriumhydroxid </td><td> Alla märken </td><td> CAS 1310-73-2 </td><td> 5 N lager </td></tr><tr><td> M9-medium </td><td> Wormlab Receptbok </td><td> <a href="http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab">http://1</a>30.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm # Commonlab </td><td> 26 </td></tr><tr><td> levamisol </td><td> Sigma </td><td> 31.742 </td><td> 100 M - 1 mm bruksspädning </td></tr><tr><td> natriumazid </td><td> Fisher Scientific </td><td> S227 </td><td> 10 mM i M9 bruksspädning </td></tr><tr><td> 24-brunnars platta </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 662.160 </td><td> VWR distributör </td></tr><tr><td> mikroskopobjektglas </td><td> Alla märken </td><td> 75 x 25 x 1 mm </td><td></td></tr><tr><td> mikroskop täckglas </td><td> Alla märken </td><td> 22 x 22 mm No.1.5 </td><td> Använda tjocklek som rekommenderas av tillverkaren mikroskop. </td></tr><tr><td> mikroskop </td><td> Carl Zeiss, Inc. </td><td> A1M </td><td> Använda mål och filter för att matcha behoven i försöket. </td></tr><tr><td> medier pumpen</td><td> Manostaten Varistaltic pumpen </td><td> Kate modell # 72-620-000 </td><td> Använd slangar och inställningar som är lämpliga för maskinen </td></tr></tbody></table>

rnai screening to identify postembryonic phenotypes in c. elegans

C. elegans har visat sig vara en värdefull modellsystem för upptäckten och funktionell karakterisering av många gener och vägar gen 1. Mer sofistikerade verktyg och resurser för studier i detta system är att underlätta fortsatt upptäckten av gener med mer subtila fenotyper eller roller. Här presenterar vi en generell protokoll vi anpassat för att identifiera C. elegans gener med postembryonic fenotyper av intresse att använda RNAi 2. Detta förfarande är lätt modifieras för att analysera fenotypen val, antingen genom ljus eller fluorescens optik på ett dissekerande eller förening mikroskop. Denna screening protokoll kapitaliserar på de fysiska tillgångar organismen och molekylära verktyg för C. elegans forskarsamhället har producerat. Som ett exempel, visar vi att använda en integrerad transgen som uttrycker en fluorescerande produkt i en RNAi avsökning för att identifiera gener som krävs för den normala lokalisering av dennaprodukt i sent skede larver och vuxna. Först använde vi ett kommersiellt tillgängligt genomiskt RNAi bibliotek med full längd cDNA insatser. Detta bibliotek underlättar snabb identifiering av flera kandidater RNAi reduktion av kandidaten genprodukten. För det andra genererade vi en integrerad transgen som uttrycker vårt fluorecently taggade proteinet av intresse i en RNAi-känslig bakgrund. Tredje genom att exponera skuggade djur RNAi tillåter denna skärm identifiering av genprodukter som har en viktig embryonal roll som annars skulle maskera en post-embryonal roll i regleringen proteinet av intresse. Slutligen använder denna skärm ett mikroskop utrustat för enskild cell upplösning.

Watch this Scientific Journal Video about RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans at JoVE.com

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

Vi beskriver en sensibiliserad metod för att identifiera postembryonic regulatorer av protein uttryck och lokalisering i<em&gt; C. elegans</em&gt; Med en RNAi-baserade genomisk skärm och en integrerad transgen som uttrycker en funktionell, fluorescensmärkta protein.

RNAi screening identifiera Postembryonic fenotyper i C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Research

JoVE Journal

Biology

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Generering av Stabil Transgena C. elegans Använda mikroinjektion

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

UPPDRAG esiRNA för RNAi screening i däggdjursceller

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

Bakteriell Leverans av RNAi Effektenheter: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening och biosensing med fluorescerande C. elegans Stammar

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Kvantitativa och automatisk hög genomströmning Genomvid RNAi skärmar i C. elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Skapa Definierade Gasformiga miljöer för att studera effekterna av Hypoxi på<em&gt; C. elegans</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans kemotaxianalys

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Antikropp färgning i<em&gt; C. Elegans</em&gt; Använda &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

Storskalig Gene Knockdown i<em&gt; C. elegans</em&gt; Med hjälp av dsRNA Feeding bibliotek för att generera Robust förlust-av-funktion Fenotyper

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

En Anoxia-svält modell för ischemi / reperfusion i<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...