Name: measurement of &#947;hv68 infection in mice
Uploaded: 2011-11-22T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Î³HV68 Infection in Mice at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke de tekniske råd og støtte fra Ren Sun (University of California, Los Angeles) og Seungmin Hwang (Washington University). Dette arbeidet ble finansiert av Baxter Foundation, National Institutes of Health tilskudd (R01 CA140964 og R21 AI083841 til C. Liang).

Følgende protokoll vil beskrive studiet av virus titer og virale genomet belastninger i lytisk og latent infeksjon syklus av γHV68 i mus, som kan teoretisk brukes til å evaluere smitte av andre virus dele lignende livsstil som for γHV68. 1. Forsterkning av γHV68 <ol><li> Tine en frossen hetteglass γHV68 i 37 ° C vannbad. </li><li> Legg viral inoculums til NIH3T12 eller 3T3 cellekultur (~ 50% confluency) i 10 cm retter og kultur de infiserte cellene ved 37 ° C i 5% CO 2. ...

<ol>
	<li>Damania, B., Choi, J. K., Jung, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+activities+of+gammaherpesvirus+membrane+proteins.">Signaling activities of gammaherpesvirus membrane proteins.</a> J. Virol. 74, 1593-1601 (2000).</li><li>Stevenson, P. G., Efstathiou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+mechanisms+in+murine+gammaherpesvirus-68+infection.">Immune mechanisms in murine gammaherpesvirus-68 infection.</a> Viral. Immunol. 18, 445-456 (2005).</li><li>Flano, E., Husain, S. M., Sample, J. T., Woodland, D. L., Blackman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent+murine+gamma-herpesvirus+infection+is+established+in+activated+B+cells,+dendritic+cells,+and+macrophages.">Latent murine gamma-herpesvirus infection is established in activated B cells, dendritic cells, and macrophages.</a> J. Immunol. 165, 1074-1081 (2000).</li><li>Sunil-Chandra, N. P., Efstathiou, S., Nash, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+gammaherpesvirus+68+establishes+a+latent+infection+in+mouse+B+lymphocytes+in+vivo.">Murine gammaherpesvirus 68 establishes a latent infection in mouse B lymphocytes in vivo.</a> J. Gen. Virol. 73, 3275-3279 (1992).</li><li>Simas, J. P., Swann, D., Bowden, R., Efstathiou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+murine+gammaherpesvirus-68+transcription+during+lytic+and+latent+infection.">Analysis of murine gammaherpesvirus-68 transcription during lytic and latent infection.</a> J. Gen. Virol. 80, 75-82 (1999).</li><li>Ganem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KSHV+and+the+pathogenesis+of+Kaposi+sarcoma:+listening+to+human+biology+and+medicine.">KSHV and the pathogenesis of Kaposi sarcoma: listening to human biology and medicine.</a> J. Clin. Invest. 120, 939-949 (2010).</li><li>Wen, K. W., Damania, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposi+sarcoma-associated+herpesvirus+(KSHV):+molecular+biology+and+oncogenesis.">Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (KSHV): molecular biology and oncogenesis.</a> Cancer. Lett. 289, 140-150 (2009).</li><li>E, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Bcl-2-mediated+evasion+of+autophagy+aids+chronic+infection+of+gammaherpesvirus+68.">Viral Bcl-2-mediated evasion of autophagy aids chronic infection of gammaherpesvirus 68.</a> PLoS. Pathog. 5, e1000609-e1000609 (2009).</li><li>Marques, S., Efstathiou, S., Smith, K. G., Haury, M., Simas, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+gene+expression+of+latent+murine+gammaherpesvirus+68+in+B+lymphocytes.">Selective gene expression of latent murine gammaherpesvirus 68 in B lymphocytes.</a> J. Virol. 77, 7308-7318 (2003).</li><li>McCausland, M. M., Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+PCR+technique+for+detecting+lymphocytic+choriomeningitis+virus+in+vivo.">Quantitative PCR technique for detecting lymphocytic choriomeningitis virus in vivo.</a> J. Virol. Methods. 147, 167-176 (2008).</li><li>Weck, K. E., Kim, S. S., Virgin, H. I., Speck, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+regulate+murine+gammaherpesvirus+68+latency.">B cells regulate murine gammaherpesvirus 68 latency.</a> J. Virol. 73, 4651-4661 (1999).</li><li>Weck, K. E., Kim, S. S., Virgin, H. I., Speck, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+are+the+major+reservoir+of+latent+murine+gammaherpesvirus+68+in+peritoneal+cells.">Macrophages are the major reservoir of latent murine gammaherpesvirus 68 in peritoneal cells.</a> J. Virol. 73, 3273-3283 (1999).</li></ol>

γHV68 har vært mye brukt som modell for å forstå patogenesen av menneskelig γ-HVS 2,4,5. I denne protokollen, beskrev vi tre rutinemessig brukes metoder, inkludert plakk analysen for smittsomme virus titer, IC analysen for viral latent belastning, og qPCR for viral genomet belastning, å vurdere den akutte og latent infeksjon av γHV68 etter intranasal inokulasjon i mus. Plakk analysen har vært brukt mye til å bestemme virus titer i infiserte celler eller vev, men den optim...

<table border="1"><tbody><tr><td> Material Name </td><td> Forberedelse Prosedyre </td></tr><tr><td> Methylcellulose (MC) overlegg medium for viral plakk assay </td><td><ol><li> Heat ~ 250 ml destillert vann i TC flaske til&gt; 80 ° C (koke i 3 minutter i mikrobølgeovn) </li><li> Legg gradvis 2,5 g MC pulveret i oppvarmet vann under omrøring over svak varme til det er oppløst. </li><li> Autoclave umiddelbart for 15 min på flytende syklus. </li><li> Rør den autoklaveres MC media ved 4 ° C over natten. </li><li> Kombiner 250 ml MC media med 200ml 2 x MEM (Gibco-BRL) + 50 ml FBS å gi 500 ml overlay media. </li></ol></td></tr><tr><td> Fix / beis medium for plakk assay </td><td> 0,2% (w / v) krystallfiolett i 20% etanol. </td></tr><tr><td> ACK Lysis Buffer </td><td> NH 4 Cl 0.15M, KHCO tre 10mm, EDTA 0.1mm </td></tr><tr><td> Komplett DMEM </td><td> Dulbecco modifiserte Eagle medium(DMEM) supplert med 10% fetal bovint serum (FBS, Invitrogen), 2 mM L-glutamin, og 1% penicillin-streptomycin (Gibco-BRL). </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Spesifikke media brukt i denne protokollen <table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagens </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> Ketamin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> K2753 </td></tr><tr><td> Xylazin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X1251 </td></tr><tr><td> Methylcellulose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0512-250g </td></tr><tr><td> 2 x MEM </td><td> Livet Technologies </td><td> 11935 </td></tr><tr><td> Cell sil </td><td> BD Faclon </td><td> 352340 </td></tr><tr><td> Omni vev homogenizer </td><td> OMNI International </td><td> TH115 </td></tr><tr><td> DNeasy Blood &amp; Tissue Kit </td><td> Qiagen </td><td> 69504 </td></tr><tr><td> iQTM SYBRH Grønn Supermix </td><td> BioRad </td><td> 170-8882 </td></tr><tr><td> CFX96 real-time PCR system </td><td> Bio-Rad </td><td> 184-5072 </td></tr><tr><td> Celleteller </td><td> Bio-Rad </td><td> 145-0001 </td></tr><tr><td> Sorvall SA-600 </td><td> Thermo Scientific </td><td> 096-124022 </td></tr></tbody></table> Tabell 2. Spesifikke reagenser og utstyr

measurement of &#947;hv68 infection in mice

γ-herpesviruses (γ-HVS) er kjent for sin evne til å etablere latente infeksjoner av lymfoide celler 1. Den smale vert spekter av menneskelige γ-HVS, som EBV og KSHV har sterkt hindret detaljerte sykdomsfremkallende studier. Murint γ-herpesvirus 68 (γHV68) aksjer omfattende genetiske og biologiske likheter med menneskelige γ-HVS og er en naturlig patogen av murid gnagere 2. Som sådan, evaluering av γHV68 infeksjon av mus innavlede stammer på ulike stadier av viral infeksjon gir en viktig modell for å forstå viral livssyklus og patogenese ved γ-HVS infeksjon. Ved intranasal inokulasjon, γHV68 infeksjon resulterer i akutt viremia i lungene som er senere løst inn i et latent infeksjon av splenocytes og andre celler, noe som kan reaktiveres gjennom hele livet av verten 3,4. I denne protokollen, vil vi beskrive hvordan du bruker plakett analysen å vurdereer smittsomt virus titer i lungene homogenates på Vero celle monolayers på et tidlig stadium (5-7 dager) etter intranasal infeksjon (dpi). Mens akutt infeksjon er i stor grad ryddet 2-3 uker postinfection, en latent infeksjon av γHV68 er etablert rundt 14 dpi og vedlikeholdes senere i milten av musene. Latent infeksjon vanligvis påvirker en svært liten populasjon av celler i infisert vev, der viruset forblir sovende og slår av de fleste av sine genuttrykk. Latent infisert splenocytes spontant reaktivere virus ved eksplantasjon i vev kultur, som kan rekapitulert av en smittsom sentrum (IC) assay å bestemme viral latent belastning. For ytterligere å anslå mengden av virale genomet eksemplarer i akutt og / eller latent infisert vev, kvantitativ real-time PCR (qPCR) brukes for maksimal følsomhet og nøyaktighet. Den kombinerte analyser av resultatene av qPCR og plakk analysen, og / eller IC analysen vil avsløre i tid og rom profiler av viralreplikering og smittsomhet in vivo.

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Î³HV68 Infection in Mice at JoVE.com

Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

γ-herpesviruses (γ-HVS) etablere livslange utholdenhet i verten sin. Infeksjon av mus med γ-HV68 gir et genetisk medgjørlig<em&gt; In vivo</em&gt; Modell for karakterisering av livssyklusen / patogenesen av γHVs. Denne protokollen beskriver påvisning og kvantifisering av γHV68 infeksjon ved akutte og latente stadier følgende infeksjon av plakk-forming, smittsomme sentrum, og qPCR analyser.

Måling av γHV68 Infeksjon i Mus

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Måling av cytosoliske Ca 2 + I isolerte kontraktile lymfesystem

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D Multimodalitet Imaging av<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infeksjoner i Mus

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Kronisk<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Luftveisinfeksjon i Mus

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

En metode for måling av Salivary kjortelen funksjon i mus

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

Høy gjennomstrømming-måling av Plasma membran Resealing effektivitet i pattedyrceller

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Evaluering av Host-patogen svar og vaksinen i mus

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Measurement of Chitinase Activity in Biological Samples

Måling av Chitinase aktivitet i biologiske prøver

Chitinases are the enzymes that cleave chitin. Even in the absence of chitin, mammalians have significant amounts of chitinases present in the body ...

Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

Evaluering av T Follikulære hjelperceller og germinal senterrespons under influensa A-virusinfeksjon hos mus

T Follicular Helper (Tfh) cells are an independent CD4+&#160;T cell subset specialized in providing help for germinal center (GC) development and ...

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

In Vivo Infeksjon med Leishmania amazonensis å evaluere parasitt virulens hos mus

Leishmania spp. are protozoan parasites that cause leishmaniases, diseases that present a wide spectrum of clinical manifestations from cutaneous to ...