Name: measurement of &#947;hv68 infection in mice
Uploaded: 2011-11-22T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Î³HV68 Infection in Mice at JoVE.com

Los autores desean agradecer el apoyo y asesoramiento técnico de Ren Sol (Universidad de California, Los Angeles) y Seungmin Hwang (Universidad de Washington). Este trabajo fue financiado por la Fundación Baxter, los Institutos Nacionales de Salud subvenciones (R01 y R21 CA140964 AI083841 a C. Liang).

El siguiente protocolo se describe el estudio de los títulos de virus y la carga viral del genoma en el ciclo de infección lítica y latente de γHV68 en ratones, lo que teóricamente se puede utilizar para evaluar la infección por virus que comparten el estilo de vida similar a la de γHV68. 1. La amplificación de γHV68 <ol><li> Descongelar un vial congelado de γHV68 de 37 ° C baño de agua. </li><li> Añadir inóculo viral NIH3T12 o cultivo de células 3T3 (~ 50% de confluencia) e...

<ol>
	<li>Damania, B., Choi, J. K., Jung, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+activities+of+gammaherpesvirus+membrane+proteins.">Signaling activities of gammaherpesvirus membrane proteins.</a> J. Virol. 74, 1593-1601 (2000).</li><li>Stevenson, P. G., Efstathiou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+mechanisms+in+murine+gammaherpesvirus-68+infection.">Immune mechanisms in murine gammaherpesvirus-68 infection.</a> Viral. Immunol. 18, 445-456 (2005).</li><li>Flano, E., Husain, S. M., Sample, J. T., Woodland, D. L., Blackman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent+murine+gamma-herpesvirus+infection+is+established+in+activated+B+cells,+dendritic+cells,+and+macrophages.">Latent murine gamma-herpesvirus infection is established in activated B cells, dendritic cells, and macrophages.</a> J. Immunol. 165, 1074-1081 (2000).</li><li>Sunil-Chandra, N. P., Efstathiou, S., Nash, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+gammaherpesvirus+68+establishes+a+latent+infection+in+mouse+B+lymphocytes+in+vivo.">Murine gammaherpesvirus 68 establishes a latent infection in mouse B lymphocytes in vivo.</a> J. Gen. Virol. 73, 3275-3279 (1992).</li><li>Simas, J. P., Swann, D., Bowden, R., Efstathiou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+murine+gammaherpesvirus-68+transcription+during+lytic+and+latent+infection.">Analysis of murine gammaherpesvirus-68 transcription during lytic and latent infection.</a> J. Gen. Virol. 80, 75-82 (1999).</li><li>Ganem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KSHV+and+the+pathogenesis+of+Kaposi+sarcoma:+listening+to+human+biology+and+medicine.">KSHV and the pathogenesis of Kaposi sarcoma: listening to human biology and medicine.</a> J. Clin. Invest. 120, 939-949 (2010).</li><li>Wen, K. W., Damania, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposi+sarcoma-associated+herpesvirus+(KSHV):+molecular+biology+and+oncogenesis.">Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (KSHV): molecular biology and oncogenesis.</a> Cancer. Lett. 289, 140-150 (2009).</li><li>E, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Bcl-2-mediated+evasion+of+autophagy+aids+chronic+infection+of+gammaherpesvirus+68.">Viral Bcl-2-mediated evasion of autophagy aids chronic infection of gammaherpesvirus 68.</a> PLoS. Pathog. 5, e1000609-e1000609 (2009).</li><li>Marques, S., Efstathiou, S., Smith, K. G., Haury, M., Simas, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+gene+expression+of+latent+murine+gammaherpesvirus+68+in+B+lymphocytes.">Selective gene expression of latent murine gammaherpesvirus 68 in B lymphocytes.</a> J. Virol. 77, 7308-7318 (2003).</li><li>McCausland, M. M., Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+PCR+technique+for+detecting+lymphocytic+choriomeningitis+virus+in+vivo.">Quantitative PCR technique for detecting lymphocytic choriomeningitis virus in vivo.</a> J. Virol. Methods. 147, 167-176 (2008).</li><li>Weck, K. E., Kim, S. S., Virgin, H. I., Speck, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+regulate+murine+gammaherpesvirus+68+latency.">B cells regulate murine gammaherpesvirus 68 latency.</a> J. Virol. 73, 4651-4661 (1999).</li><li>Weck, K. E., Kim, S. S., Virgin, H. I., Speck, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+are+the+major+reservoir+of+latent+murine+gammaherpesvirus+68+in+peritoneal+cells.">Macrophages are the major reservoir of latent murine gammaherpesvirus 68 in peritoneal cells.</a> J. Virol. 73, 3273-3283 (1999).</li></ol>

γHV68 ha sido ampliamente utilizada como modelo para entender la patogénesis de los derechos humanos γ-VS 2,4,5. En este protocolo, se describen tres métodos de rutina utilizados, incluyendo la placa de ensayo para el título de virus infecciosos, ensayo de IC de la carga viral latente, y qPCR para la carga del genoma viral, para evaluar la infección aguda y latente de γHV68 después de la inoculación intranasal en ratones. La placa de ensayo se ha utilizado ampliamente par...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del Material </td><td> Procedimiento de preparación </td></tr><tr><td> Metilcelulosa (MC) superposición medio de ensayo de placa viral </td><td><ol><li> Calor ~ 250 ml de agua destilada en la botella TC a&gt; 80 ° C (hirviendo durante 3 minutos en el microondas) </li><li> Añadir poco a poco 2,5 g de polvo MC en agua caliente, revolviendo a fuego lento hasta que se disuelva. </li><li> Autoclave durante 15 minutos inmediatamente a un ciclo de líquido. </li><li> La agitación de la autoclave medios MC a 4 ° C durante la noche. </li><li> Combine 250 ml con 200 ml de medios MC 2 x MEM (Gibco-BRL) + 50 ml de FBS para dar 500 ml de medios de superposición. </li></ol></td></tr><tr><td> Fix / mancha por medio de la placa de ensayo </td><td> 0,2% (w / v) de cristal violeta en etanol al 20%. </td></tr><tr><td> Tampón de lisis ACK </td><td> NH 4 Cl 0,15 M, KHCO3 10 mM, EDTA 0,1 mM </td></tr><tr><td> DMEM completo </td><td> Dulbecco modificado de Eagle(DMEM) suplementado con suero fetal bovino al 10% (FBS, Invitrogen), 2 mM L-glutamina, y el 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco-BRL). </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Específicas de medios utilizados en este protocolo <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> La ketamina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> K2753 </td></tr><tr><td> Xilazina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X1251 </td></tr><tr><td> Metilcelulosa </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0512-250g </td></tr><tr><td> 2 x MEM </td><td> Tecnologías de la Vida </td><td> 11935 </td></tr><tr><td> Células colador </td><td> BD Faclon </td><td> 352340 </td></tr><tr><td> Omni homogeneizador de tejidos </td><td> OMNI Internacional </td><td> TH115 </td></tr><tr><td> Sangre y DNeasy Tissue Kit </td><td> Qiageneración </td><td> 69504 </td></tr><tr><td> IQTM SYBRH Green Supermix </td><td> BioRad </td><td> 170-8882 </td></tr><tr><td> CFX96 PCR en tiempo real del sistema </td><td> Bio-Rad </td><td> 184-5072 </td></tr><tr><td> Contador de células </td><td> Bio-Rad </td><td> 145-0001 </td></tr><tr><td> Sorvall SA-600 </td><td> Thermo Scientific </td><td> 096-124022 </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Reactivos y equipos específicos

measurement of &#947;hv68 infection in mice

γ-herpesvirus (γ-VS) se caracterizan por su capacidad para establecer infecciones latentes de las células linfoides 1. El rango de hospedadores de los derechos humanos γ-VS, como EBV y HVSK, ha obstaculizado seriamente los estudios detallados patógenos. Murinas herpesvirus γ-68 (γHV68) acciones amplias similitudes genéticas y biológicas con humanos γ-VS y es un patógeno natural de los roedores múridos 2. Como tal, la evaluación de γHV68 infección de ratones puras cepas en diferentes etapas de la infección viral constituye un modelo importante para la comprensión del ciclo de vida viral y patogenia en γ-VS infección. Tras la inoculación intranasal, γHV68 infección da lugar a una viremia aguda en el pulmón que luego resuelve en una infección latente de esplenocitos y otras células, que puede ser reactivado durante la vida del huésped 3,4. En este protocolo, se describe cómo utilizar la placa de ensayo para evaluartítulo de s virus infeccioso en el pulmón homogeneizado en monocapas de células Vero en la primera etapa (5-7 días) después de la infección intranasal (dpi). Mientras que la infección aguda es en gran parte aclaró 2-3 postinfección semana, una infección latente de γHV68 se establece alrededor de 14 dpi y mantenido posteriormente en el bazo de los ratones. La infección latente por lo general afecta a una población muy pequeña de células en los tejidos infectados, por el cual el virus permanece latente y se apaga la mayor parte de su expresión génica. Esplenocitos latente infectadas por el virus de reactivar de manera espontánea en explante en cultivo de tejidos, que puede ser recapitulado en un centro de infecciosos (IC) de ensayo para determinar la carga viral latente. A fin de estimar la cantidad de copias del genoma viral en la forma aguda y / o tejidos con infección latente, la PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) se utiliza para su máxima sensibilidad y precisión. El análisis combinado de los resultados de ensayo qPCR y la placa, y / o ensayo de IC se muestran los perfiles de espacio-temporal de los virusla replicación y la infectividad in vivo.

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Î³HV68 Infection in Mice at JoVE.com

Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

γ-herpesvirus (γ-VS) establecer la persistencia de toda la vida en su huésped. La infección de ratones con γ-HV68 ofrece un manejable de forma genética<em&gt; En vivo</em&gt; Modelo para la caracterización del ciclo de vida / patogenia de γHVs. Este protocolo describe la detección y cuantificación de γHV68 infección en las fases aguda y después de la infección latente por la placa de formación, centro de infecciosos, y los ensayos de PCR cuantitativa.

La medición de γHV68 infección en los ratones

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

Un método para etiquetar los Vasos sanguíneos en embriones de ratones

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

Investigación

Inmunología e Infección

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Medición de la citosólica de Ca 2 + En aislados linfáticos contráctil

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D de imágenes multimodalidad<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Las infecciones en ratones

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Crónica a largo plazo<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infección de las vías respiratorias en los ratones

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

Un método para la medición de la función de la glándula salival en ratones

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

Medida de alto rendimiento de membrana plasmática resellado eficacia en células de mamíferos

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Evaluación de las respuestas del huésped-patógeno y eficacia de la vacuna en ratones

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Measurement of Chitinase Activity in Biological Samples

Medición de la actividad de la chitinasa en muestras biológicas

Chitinases are the enzymes that cleave chitin. Even in the absence of chitin, mammalians have significant amounts of chitinases present in the body ...

Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

Evaluación de las células auxiliares foliculares T y la respuesta del centro germinal durante la infección por el virus de la gripe A en ratones

T Follicular Helper (Tfh) cells are an independent CD4+&#160;T cell subset specialized in providing help for germinal center (GC) development and ...

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

In Vivo infección con Leishmania amazonensis para evaluar la virulencia del parásito en ratones

Leishmania spp. are protozoan parasites that cause leishmaniases, diseases that present a wide spectrum of clinical manifestations from cutaneous to ...