Name: measurement of &#947;hv68 infection in mice
Uploaded: 2011-11-22T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Î³HV68 Infection in Mice at JoVE.com

Författarna vill tacka för de tekniska råd och stöd från Ren Sun (University of California, Los Angeles) och Seungmin Hwang (Washington University). Detta arbete har finansierats av Baxter Foundation, National Institutes of Health bidrag (R01 CA140964 och R21 AI083841 till C. Liang).

Följande protokoll kommer att beskriva studiet av viruset antikroppnivåer och virushalt genomet i lytiska och latent infektion cykel γHV68 hos möss, som teoretiskt kan användas för att utvärdera infektion av andra virus med liknande livsstil som γHV68. 1. Förstärkning av γHV68 <ol><li> Tina ett fruset injektionsflaska med γHV68 i 37 ° C vattenbad. </li><li> Lägg virus inoculums till NIH3T12 eller 3T3 cellkultur (~ 50% confluency) i 10 cm rätter och kultur de infekterade cell...

<ol>
	<li>Damania, B., Choi, J. K., Jung, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+activities+of+gammaherpesvirus+membrane+proteins.">Signaling activities of gammaherpesvirus membrane proteins.</a> J. Virol. 74, 1593-1601 (2000).</li><li>Stevenson, P. G., Efstathiou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+mechanisms+in+murine+gammaherpesvirus-68+infection.">Immune mechanisms in murine gammaherpesvirus-68 infection.</a> Viral. Immunol. 18, 445-456 (2005).</li><li>Flano, E., Husain, S. M., Sample, J. T., Woodland, D. L., Blackman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent+murine+gamma-herpesvirus+infection+is+established+in+activated+B+cells,+dendritic+cells,+and+macrophages.">Latent murine gamma-herpesvirus infection is established in activated B cells, dendritic cells, and macrophages.</a> J. Immunol. 165, 1074-1081 (2000).</li><li>Sunil-Chandra, N. P., Efstathiou, S., Nash, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+gammaherpesvirus+68+establishes+a+latent+infection+in+mouse+B+lymphocytes+in+vivo.">Murine gammaherpesvirus 68 establishes a latent infection in mouse B lymphocytes in vivo.</a> J. Gen. Virol. 73, 3275-3279 (1992).</li><li>Simas, J. P., Swann, D., Bowden, R., Efstathiou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+murine+gammaherpesvirus-68+transcription+during+lytic+and+latent+infection.">Analysis of murine gammaherpesvirus-68 transcription during lytic and latent infection.</a> J. Gen. Virol. 80, 75-82 (1999).</li><li>Ganem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KSHV+and+the+pathogenesis+of+Kaposi+sarcoma:+listening+to+human+biology+and+medicine.">KSHV and the pathogenesis of Kaposi sarcoma: listening to human biology and medicine.</a> J. Clin. Invest. 120, 939-949 (2010).</li><li>Wen, K. W., Damania, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposi+sarcoma-associated+herpesvirus+(KSHV):+molecular+biology+and+oncogenesis.">Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (KSHV): molecular biology and oncogenesis.</a> Cancer. Lett. 289, 140-150 (2009).</li><li>E, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Bcl-2-mediated+evasion+of+autophagy+aids+chronic+infection+of+gammaherpesvirus+68.">Viral Bcl-2-mediated evasion of autophagy aids chronic infection of gammaherpesvirus 68.</a> PLoS. Pathog. 5, e1000609-e1000609 (2009).</li><li>Marques, S., Efstathiou, S., Smith, K. G., Haury, M., Simas, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+gene+expression+of+latent+murine+gammaherpesvirus+68+in+B+lymphocytes.">Selective gene expression of latent murine gammaherpesvirus 68 in B lymphocytes.</a> J. Virol. 77, 7308-7318 (2003).</li><li>McCausland, M. M., Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+PCR+technique+for+detecting+lymphocytic+choriomeningitis+virus+in+vivo.">Quantitative PCR technique for detecting lymphocytic choriomeningitis virus in vivo.</a> J. Virol. Methods. 147, 167-176 (2008).</li><li>Weck, K. E., Kim, S. S., Virgin, H. I., Speck, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+regulate+murine+gammaherpesvirus+68+latency.">B cells regulate murine gammaherpesvirus 68 latency.</a> J. Virol. 73, 4651-4661 (1999).</li><li>Weck, K. E., Kim, S. S., Virgin, H. I., Speck, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+are+the+major+reservoir+of+latent+murine+gammaherpesvirus+68+in+peritoneal+cells.">Macrophages are the major reservoir of latent murine gammaherpesvirus 68 in peritoneal cells.</a> J. Virol. 73, 3273-3283 (1999).</li></ol>

γHV68 har i stor utsträckning använts som en modell för att förstå uppkomsten av mänskliga γ-HVS 2,4,5. I detta protokoll beskrivs vi tre rutinmässigt används metoder, inklusive plack analys för smittsamma virus titer, IC-analys för virus latent belastning och qPCR för virusgenom last, för att utvärdera akut och latent infektion av γHV68 efter intranasal inokulationen hos möss. På skylten analys har använts i stor utsträckning att bestämma viruset titer i infe...

<table border="1"><tbody><tr><td> Materialnamn </td><td> Beredningen </td></tr><tr><td> Metylcellulosa (MC) overlay medium för viral plack analys </td><td><ol><li> Värm ~ 250 ml destillerat vatten i TC flaska till&gt; 80 ° C (koka i 3 min i mikrovågsugn) </li><li> Tillsätt gradvis 2,5 g MC pulvret i uppvärmt vatten, rör om på svag värme tills det är upplöst. </li><li> Autoklav omedelbart i 15 min vid flytande cykel. </li><li> Omrörning av autoklaveras MC media vid 4 ° C över natten. </li><li> Kombinera 250 ml MC media med 200ml 2 x MEM (Gibco-BRL) + 50 ml FBS att ge 500 ml överliggande medier. </li></ol></td></tr><tr><td> Fix / bets medium för plack analys </td><td> 0,2% (w / v) kristallviolett i 20% etanol. </td></tr><tr><td> ACK lyseringsbuffert </td><td> NH 4 Cl 0,15, KHCO 3 10mm, EDTA 0.1mm </td></tr><tr><td> Komplett DMEM </td><td> Dulbecco ändrade Eagle på medellång(DMEM) kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS, Invitrogen), 2 mm L-glutamin, och 1% penicillin-streptomycin (Gibco-BRL). </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Specifika medier används i detta protokoll <table border="1"><tbody><tr><td> Reagensets namn </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> Ketamin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> K2753 </td></tr><tr><td> Xylazine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X1251 </td></tr><tr><td> Metylcellulosa </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0512-250g </td></tr><tr><td> 2 x MEM </td><td> Livet Technologies </td><td> 11.935 </td></tr><tr><td> Cell sil </td><td> BD Faclon </td><td> 352.340 </td></tr><tr><td> Omni vävnad homogeniseringsblandare </td><td> OMNI International </td><td> TH115 </td></tr><tr><td> DNeasy Blood &amp; Tissue Kit </td><td> Qiagen </td><td> 69.504 </td></tr><tr><td> iQTM SYBRH Grön Supermix </td><td> BioRad </td><td> 170-8882 </td></tr><tr><td> CFX96 realtids-PCR-system </td><td> Bio-Rad </td><td> 184-5072 </td></tr><tr><td> Celltalsräknare </td><td> Bio-Rad </td><td> 145-0001 </td></tr><tr><td> Sorvall SA-600 </td><td> Thermo Scientific </td><td> 096-124022 </td></tr></tbody></table> Tabell 2. Specifika reagenser och utrustningar

measurement of &#947;hv68 infection in mice

γ-herpesvirus (γ-HVS) är anmärkningsvärda för sin förmåga att skapa latenta infektioner av lymfoida celler 1. Den smala värdspektrum av mänskliga γ-HVS, såsom EBV och KSHV, har utgjort ett allvarligt hinder detaljerade patogena studier. Murina γ-herpesvirus 68 (γHV68) aktier omfattande genetiska och biologiska likheter med mänskliga γ-HVS och är en naturlig patogen till murid gnagare 2. Som sådan, utvärdering av γHV68 infektion hos möss inavlade stammar i olika stadier av virusinfektion ger en viktig modell för att förstå virus livscykel och patogenes vid γ-HVS infektion. Efter nasal ympning, som γHV68 infektion resulterar i akut viremi i lungan är senare lösas in i en latent infektion av splenocytes och andra celler, som kan aktiveras under hela värden 3,4. I detta protokoll kommer vi att beskriva hur du använder plack analysen att bedömas infektiöst virus titer i lungan homogenat på Vero cell monolager i ett tidigt skede (5 - 7 dagar) av post-intranasalt infektion (dpi). Medan akut infektion är i stort sett rensat 2 - 3 veckor postinfection, en latent infektion av γHV68 är etablerad runt 14 dpi och underhållas senare i mjälten på möss. Latent infektion drabbar oftast en mycket liten population av celler i infekterade vävnader, där viruset stannar vilande och stänger de flesta av dess genuttryck. Latent infekterade splenocytes reaktivera spontant viruset vid explantation i vävnadsodling, som kan rekapituleras av en smittsam centrum (IC) analys för att bestämma virus latent belastning. För att ytterligare uppskatta mängden virala genomet exemplar i akut och / eller latent infekterade vävnader, kvantitativ realtids-PCR (qPCR) används för maximal känslighet och precision. Den kombinerade analyser av resultaten av qPCR och plack analys och / eller IC-analysen kommer att avslöja Spatiotemporal profiler av viralareplikering och smittsamhet in vivo.

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Î³HV68 Infection in Mice at JoVE.com

Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

γ-herpesvirus (γ-HVS) etablera livslång persistens i sin värd. Infektion av möss med γ-HV68 ger ett genetiskt lätthanterlig<em&gt; In vivo</em&gt; Modell för karakterisering av livscykeln / patogenesen av γHVs. Detta protokoll beskriver detektering och kvantifiering av γHV68 infektion vid akut och latent ligger efter infektion av plaque-forming, infektionssjukdomar centrum och analyser qPCR.

Mätning av γHV68 infektion hos möss

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

En metod för märkning vaskulatur i embryonala möss

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Mätning av cytosoliska Ca 2 + I enstaka kontraktila lymphatics

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D Multimodalitet Imaging av<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infektioner hos möss

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Långsiktig Kronisk<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Airway infektion hos möss

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

En metod för mätning av Saliv-körtel funktion hos möss

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

Hög genomströmning mätning av plasmamembranet återförslutning effektivitet i däggdjursceller

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Utvärdering av värd-patogen svaren och vaccinets effekt hos möss

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Measurement of Chitinase Activity in Biological Samples

Mätning av Chitinas aktivitet i biologiska prover

Chitinases are the enzymes that cleave chitin. Even in the absence of chitin, mammalians have significant amounts of chitinases present in the body ...

Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

Utvärdering av T Follicular Helper Celler och Germinal Center Svar under influensa A Virusinfektion hos möss

T Follicular Helper (Tfh) cells are an independent CD4+&#160;T cell subset specialized in providing help for germinal center (GC) development and ...

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

In Vivo Infektion med Leishmania amazonensis att utvärdera parasit virulens i möss

Leishmania spp. are protozoan parasites that cause leishmaniases, diseases that present a wide spectrum of clinical manifestations from cutaneous to ...