وأيد هذا العمل من قبل الجائزة NSF # 0920274 وجنوب كارولينا تجربة مشروع محطة (SC - 1700340) لKSS. هذه الورقة التقنية رقم 5929 من المساهمة في تجربة جامعة كليمسون محطة.

ويبين المخطط العام لهذا البروتوكول في الشكل 1. 1. تحضير محلول قياسي المنحنيات وفحوصات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير 100 مل من محلول مول / لتر 2 من هيدروكسيل ، حمض الهيدروكلوريك. خارج تزن 13.9 غرام من هيدروكلوري...

<ol>
	<li>Bork, P., Sander, C., Valencia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ATPase+domain+common+to+prokaryotic+cell+cycle+proteins,+sugar+kinases,+actin,+and+hsp70+heat+shock+proteins.">An ATPase domain common to prokaryotic cell cycle proteins, sugar kinases, actin, and hsp70 heat shock proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 7290-7294 (1992).</li><li>Bork, P., Sander, C., Valencia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+evolution+of+similar+enzymatic+function+on+different+protein+folds:+the+hexokinase,+ribokinase,+and+galactokinase+families+of+sugar+kinases.">Convergent evolution of similar enzymatic function on different protein folds: the hexokinase, ribokinase, and galactokinase families of sugar kinases.</a> Protein Sci. 2, 31-40 (1993).</li><li>Buss, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urkinase:+structure+of+acetate+kinase,+a+member+of+the+ASKHA+superfamily+of+phosphotransferases.">Urkinase: structure of acetate kinase, a member of the ASKHA superfamily of phosphotransferases.</a> J. Bacteriol. 183, 680-686 (2001).</li><li>Hurley, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sugar+kinase/heat+shock+protein+70/actin+superfamily:+implications+of+conserved+structure+for+mechanism.">The sugar kinase/heat shock protein 70/actin superfamily: implications of conserved structure for mechanism.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 25, 137-162 (1996).</li><li>Holmes, K. C., Sander, C., Valencia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+ATP-binding+fold+in+actin,+hexokinase+and+Hsc70.">A new ATP-binding fold in actin, hexokinase and Hsc70.</a> Trends. Cell. Biol. 3, 53-59 (1993).</li><li>Ingram-Smith, C., Martin, S. R., Smith, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetate+kinase:+not+just+a+bacterial+enzyme.">Acetate kinase: not just a bacterial enzyme.</a> Trends. Microbiol. 14, 249-253 (2006).</li><li>Aceti, D. J., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+acetate+kinase+from+acetate-grown+Methanosarcina+thermophila.+Evidence+for+regulation+of+synthesis.">Purification and characterization of acetate kinase from acetate-grown Methanosarcina thermophila. Evidence for regulation of synthesis.</a> J. Biol. Chem. 263, 15444-15448 (1988).</li><li>Latimer, M. T., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning,+sequence+analysis,+and+hyperexpression+of+the+genes+encoding+phosphotransacetylase+and+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila.">Cloning, sequence analysis, and hyperexpression of the genes encoding phosphotransacetylase and acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Bacteriol. 175, 6822-6829 (1993).</li><li>Ingram-Smith, C., Barber, R. D., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+histidines+in+the+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila.">The role of histidines in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 275, 33765-33770 (2000).</li><li>Miles, R. D., Iyer, P. P., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-directed+mutational+analysis+of+active+site+residues+in+the+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila.">Site-directed mutational analysis of active site residues in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 276, 45059-45064 (2001).</li><li>Miles, R. D., Gorrell, A., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+transition+state+analog,+MgADP-aluminum+fluoride-acetate,+in+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila.">Evidence for a transition state analog, MgADP-aluminum fluoride-acetate, in acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 277, 22547-22552 (2002).</li><li>Ingram-Smith, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+acetate+binding+pocket+in+the+Methanosarcina+thermophila+acetate+kinase.">Characterization of the acetate binding pocket in the Methanosarcina thermophila acetate kinase.</a> J. Bacteriol. 187, 2386-2394 (2005).</li><li>Gorrell, A., Lawrence, S. H., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+kinetic+analyses+of+arginine+residues+in+the+active+site+of+the+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila.">Structural and kinetic analyses of arginine residues in the active site of the acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 280, 10731-10742 (2005).</li><li>Gorrell, A., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+Methanosarcina+thermophila+acetate+kinase+mechanism+by+fluorescence+quenching.">Investigation of the Methanosarcina thermophila acetate kinase mechanism by fluorescence quenching.</a> Biochemistry. 46, 14170-14176 (2007).</li><li>Reeves, R. E., Guthrie, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetate+kinase+(pyrophosphate).+A+fourth+pyrophosphate-dependent+kinase+from+Entamoeba+histolytica.">Acetate kinase (pyrophosphate). A fourth pyrophosphate-dependent kinase from Entamoeba histolytica.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 66, 1389-1395 (1975).</li><li>Fowler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+and+structural+characterization+of+the+novel+PPi-dependent+acetate+kinase+from+the+parasite+Entamoeba+histolytica.">Kinetic and structural characterization of the novel PPi-dependent acetate kinase from the parasite Entamoeba histolytica.</a> , (2011).</li><li>Lipmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+synthesis+of+acetyl+phosphate.">Enzymatic synthesis of acetyl phosphate.</a> J. Biol. Chem. 155, 55-70 (1944).</li><li>Lipmann, F., Tuttle, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+micromethod+for+determination+of+acyl+phosphates.">A specific micromethod for determination of acyl phosphates.</a> J. Biol. Chem. 159, 21-28 (1945).</li><li>Lipmann, F., Jones, M. E., Black, S., Flynn, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+the+ATP-CoA-acetate+reaction.">The mechanism of the ATP-CoA-acetate reaction.</a> J. Cell. Physiol. Suppl. 41, 109-112 (1953).</li><li>Rose, I. A., Grunberg-Manago, M., Korey, S. F., Ochoa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+phosphorylation+of+acetate.">Enzymatic phosphorylation of acetate.</a> J. Biol. Chem. 211, 737-756 (1954).</li><li>Allen, S. H., Kellermeyer, R. W., Stjernholm, R. L., Wood, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+properties+of+enzymes+involved+in+the+proponic+acid+fermentation.">Purification and properties of enzymes involved in the proponic acid fermentation.</a> Journal of Bacteriology. 87, 171-187 (1964).</li><li>Clarke, P. M., Payton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzymatic+assay+for+acetate+in+spent+bacterial+culture+supernatants.">An enzymatic assay for acetate in spent bacterial culture supernatants.</a> Anal. Biochem. 130, 402-405 (1983).</li><li>Mukhopadhyay, S., Hasson, M. S., Sanders, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+assay+of+acetate+kinase+activity:+measurement+of+inorganic+phosphate+release+generated+by+hydroxylaminolysis+of+acetyl+phosphate.">A continuous assay of acetate kinase activity: measurement of inorganic phosphate release generated by hydroxylaminolysis of acetyl phosphate.</a> Bioorg. Chem. 36, 65-69 (2008).</li><li>Nakajima, H., Suzuki, K., Imahori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+properties+of+acetate+kinase+from+Bacillus+stearothermophilus.">Purification and properties of acetate kinase from Bacillus stearothermophilus.</a> J. Biochem. 84, 193-203 (1978).</li></ol>

الكشف عن الفوسفات الاسيتيل في هذا الاختبار يعتمد على تركيز كاف من هيدروكلوريد هيدروكسيل والتركيز والحموضة من محلول كلوريد الحديديك. وتغيير حجم مقايسة تتطلب إعادة النظر في كل من هذه المكونات. ردود الفعل الأنزيمية الموصوفة هنا أجريت في 37 درجة مئوية مع انتهاء تنفيذ هي?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td width="160"> اسم الكاشف </td><td width="108"> شركة </td><td width="134"> فهرس العدد </td><td width="103"> تعليقات </td></tr><tr><td> الاسيتيل الفوسفات </td><td> سيغما الدريتش </td><td> 01409 </td><td> ملح الليثيوم (97 ٪) </td></tr><tr><td> فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة (يذوى) </td><td> ThermoFisher </td><td> S381 </td><td></td></tr><tr><td> ثنائي القاعدة فوسفات الصوديوم (اللامائية) </td><td> ThermoFisher </td><td> S374 </td><td></td></tr><tr><td> كلوريد المغنيسيوم (hexahydrate) </td><td> ThermoFisher </td><td> M33 </td><td></td></tr><tr><td> قاعدة تريس </td><td> ThermoFisher </td><td> B152 </td><td></td></tr><tr><td> كلوريد الحديديك (hexahydrate) </td><td> ThermoFisher </td><td> I88 </td><td></td></tr><tr><td> حمض التريكلوروسيتيك حمض </td><td> ThermoFisher </td><td> A324 </td><td></td></tr><tr><td> هيدروكسيل هيدروكلوريد </td><td> ThermoFisher </td><td> H330 </td><td></td></tr><tr><td> ثنائي فسفات الأدينوزين 5&#39; - ملح الصوديوم </td><td> سيغما الدريتش </td><td> A2754 </td><td></td></tr><tr><td> Biomate الثالث الطيف </td><td> ThermoFisher </td><td> 142982082 </td><td> مستوى الأشعة فوق البنفسجية / معمل فيس </td></tr></table>

direct detection of the acetate-forming activity  of the enzyme acetate kinase

كيناز خلات ، عضوا في لخلات والسكر كيناز - Hsp70 - الأكتين فوق الفصيلة انزيم (ASKHA) 1-5 ، هو المسؤول عن الفسفرة عكسها من خلات لاستغلال الفوسفات ATP الاسيتيل باعتبارها الركيزة. كاينيسات خلات موجودة في كل مكان في البكتيريا وجدت في أحد من جنس الأركيا ، وموجودة أيضا في الميكروبات من حقيقيات النوى 6. وتتميز معظم كيناز خلات جيدا هو أن من thermophila المنتجة للغاز الميثان Methanosarcina archaeon 7-14. وقد تم عزل وكيناز خلات التي تستطيع الاستفادة منها فقط PP ط ولكن ليس للاعبي التنس المحترفين في اتجاه تشكيل الاسيتيل الفوسفات من نسج المتحولة ، والعامل المسبب للمرض الزحار الأميبي ، وحتى الآن فقط تم العثور على 15،16 في هذا جنس. في اتجاه تشكيل الفوسفات الاسيتيل ، ويقاس عادة خلات النشاط كيناز باستخدام مقايسة hydroxamate ، وصف لأول مرة من قبل Lipmann17-20 ، ومقايسة يقترن التي يقترن تحويل ATP إلى ADP للأكسدة NADH إلى NAD + من كيناز البيروفات الانزيمات واللاكتات نازعة 21،22 ، أو فحص قياس الافراج عن الفوسفات غير العضوية بعد رد فعل للمنتج الفوسفات الاسيتيل مع هيدروكسيل 23. النشاط في المقابل ، يقاس خلات تشكيل الاتجاه اقتران تشكيل ATP من ADP في الحد من NADP + إلى NADPH من هيكسوكيناز الانزيمات والجلوكوز 6 فوسفات نازعة 24. نحن هنا وصف طريقة للكشف عن النشاط كيناز خلات في اتجاه تشكيل خلات التي لا تتطلب اقتران الانزيمات ، ولكن بدلا من ذلك على ويستند تقرير المباشر للاستهلاك الفوسفات الاسيتيل. بعد رد الفعل الأنزيمية ، يتم تحويل الفوسفات الاسيتيل المتبقية لمجمع الحديد hydroxamate التي يمكن قياسها spectrophotometrically ، أما بالنسبة للمقايسة hydroxamate. وهكذا ، خلافا للشارعandard مقايسة بالإضافة لهذا الاتجاه الذي يعتمد على إنتاج ATP من ADP ، ويمكن استخدام هذا الاختبار المباشر لتحركات خلات التي تنتج ATP أو PP ط.

Watch this Scientific Journal Video about Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase at JoVE.com

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

يوصف أسلوب لتحديد النشاط كيناز خلات. هذا الاختبار يستخدم لتحديد رد الفعل المباشر لنشاط إنزيم وحركية كيناز خلات في اتجاه تشكيل خلات مع يقبلون فسفوريل مختلفة. وعلاوة على ذلك ، يمكن استخدام هذه الطريقة لمعايرة الفوسفات الاسيتيل أخرى أو أسيتيل التميم استخدام الانزيمات.

الكشف عن مباشرة النشاط خلات تشكيل لأنزيم كيناز خلات

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of Protein Ubiquitination

اكتشاف بروتين Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

استخدام أدوات الكشف البروتياز نيون تحديد نشاط الأنزيم البروتيني

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Method for Mycotoxin Detection

ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection

ELIME (انزيم مرتبط المناعي المغناطيسي الكهروكيميائية) طرق الكشف عن السموم الفطرية

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

إنتاج المعدلة وراثيا القيطم المورق عن طريق تقييد أنزيم التكامل وساطة وزرع النووية

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

اكتشاف اكسيد النيتريك وانيون الراديكالي فوق الأكسيد بواسطة الكترون ممغطس التحليل الطيفي بالرنين من الخلايا باستخدام الفخاخ سبين

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

رصد كيناز والفوسفاتيز الأنشطة من خلال دورة الخلية التي Ratiometric الحنق

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

يعاير النشاط كيناز من LRRK2 في المختبر</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

GC-based Detection of Aldononitrile Acetate Derivatized Glucosamine and Muramic Acid for Microbial Residue Determination in Soil

GC القائم على الكشف عن حمض Aldononitrile خلات الجلوكوزامين والموراميك Derivatized لتحديد بقايا الميكروبي في التربة

Quantitative approaches to characterizing microorganisms are crucial for a broader understanding of the microbial status and function within ecosystems. ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

قياس اليرقات آخر في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مراقبة النشاط

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito

دراسة نشاط الببتيدات العصبية وغيرها من منظمات نظام الإخراج في البعوض البالغ

Studies of insect physiology, particularly in those species that are vectors of pathogens causing disease in humans and other vertebrates, provide the ...