עבודה זו נתמכה על ידי הפרס NSF # 0920274 ודרום קרוליינה תחנת ניסוי פרויקט (SC-1700340) כדי KSS. נייר זה לא תרומה טכני 5929 של תחנת הניסיונות אוניברסיטת קלמסון.

התוכנית הכוללת של פרוטוקול זה הוא התווה באיור 1. 1. הפתרון הכנה Curves ואת מבחני תקן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו 100 מ&quot;ל של פתרון mol / L 2 של hydroxylamine-HCl. לשקול את 13.9 גרם של hydrochloride hydroxylamine (MW 69.49 g / mol) ו להתמוסס במי?...

<ol>
	<li>Bork, P., Sander, C., Valencia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ATPase+domain+common+to+prokaryotic+cell+cycle+proteins,+sugar+kinases,+actin,+and+hsp70+heat+shock+proteins.">An ATPase domain common to prokaryotic cell cycle proteins, sugar kinases, actin, and hsp70 heat shock proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 7290-7294 (1992).</li><li>Bork, P., Sander, C., Valencia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+evolution+of+similar+enzymatic+function+on+different+protein+folds:+the+hexokinase,+ribokinase,+and+galactokinase+families+of+sugar+kinases.">Convergent evolution of similar enzymatic function on different protein folds: the hexokinase, ribokinase, and galactokinase families of sugar kinases.</a> Protein Sci. 2, 31-40 (1993).</li><li>Buss, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urkinase:+structure+of+acetate+kinase,+a+member+of+the+ASKHA+superfamily+of+phosphotransferases.">Urkinase: structure of acetate kinase, a member of the ASKHA superfamily of phosphotransferases.</a> J. Bacteriol. 183, 680-686 (2001).</li><li>Hurley, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sugar+kinase/heat+shock+protein+70/actin+superfamily:+implications+of+conserved+structure+for+mechanism.">The sugar kinase/heat shock protein 70/actin superfamily: implications of conserved structure for mechanism.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 25, 137-162 (1996).</li><li>Holmes, K. C., Sander, C., Valencia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+ATP-binding+fold+in+actin,+hexokinase+and+Hsc70.">A new ATP-binding fold in actin, hexokinase and Hsc70.</a> Trends. Cell. Biol. 3, 53-59 (1993).</li><li>Ingram-Smith, C., Martin, S. R., Smith, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetate+kinase:+not+just+a+bacterial+enzyme.">Acetate kinase: not just a bacterial enzyme.</a> Trends. Microbiol. 14, 249-253 (2006).</li><li>Aceti, D. J., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+acetate+kinase+from+acetate-grown+Methanosarcina+thermophila.+Evidence+for+regulation+of+synthesis.">Purification and characterization of acetate kinase from acetate-grown Methanosarcina thermophila. Evidence for regulation of synthesis.</a> J. Biol. Chem. 263, 15444-15448 (1988).</li><li>Latimer, M. T., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning,+sequence+analysis,+and+hyperexpression+of+the+genes+encoding+phosphotransacetylase+and+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila.">Cloning, sequence analysis, and hyperexpression of the genes encoding phosphotransacetylase and acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Bacteriol. 175, 6822-6829 (1993).</li><li>Ingram-Smith, C., Barber, R. D., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+histidines+in+the+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila.">The role of histidines in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 275, 33765-33770 (2000).</li><li>Miles, R. D., Iyer, P. P., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-directed+mutational+analysis+of+active+site+residues+in+the+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila.">Site-directed mutational analysis of active site residues in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 276, 45059-45064 (2001).</li><li>Miles, R. D., Gorrell, A., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+transition+state+analog,+MgADP-aluminum+fluoride-acetate,+in+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila.">Evidence for a transition state analog, MgADP-aluminum fluoride-acetate, in acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 277, 22547-22552 (2002).</li><li>Ingram-Smith, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+acetate+binding+pocket+in+the+Methanosarcina+thermophila+acetate+kinase.">Characterization of the acetate binding pocket in the Methanosarcina thermophila acetate kinase.</a> J. Bacteriol. 187, 2386-2394 (2005).</li><li>Gorrell, A., Lawrence, S. H., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+kinetic+analyses+of+arginine+residues+in+the+active+site+of+the+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila.">Structural and kinetic analyses of arginine residues in the active site of the acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 280, 10731-10742 (2005).</li><li>Gorrell, A., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+Methanosarcina+thermophila+acetate+kinase+mechanism+by+fluorescence+quenching.">Investigation of the Methanosarcina thermophila acetate kinase mechanism by fluorescence quenching.</a> Biochemistry. 46, 14170-14176 (2007).</li><li>Reeves, R. E., Guthrie, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetate+kinase+(pyrophosphate).+A+fourth+pyrophosphate-dependent+kinase+from+Entamoeba+histolytica.">Acetate kinase (pyrophosphate). A fourth pyrophosphate-dependent kinase from Entamoeba histolytica.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 66, 1389-1395 (1975).</li><li>Fowler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+and+structural+characterization+of+the+novel+PPi-dependent+acetate+kinase+from+the+parasite+Entamoeba+histolytica.">Kinetic and structural characterization of the novel PPi-dependent acetate kinase from the parasite Entamoeba histolytica.</a> , (2011).</li><li>Lipmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+synthesis+of+acetyl+phosphate.">Enzymatic synthesis of acetyl phosphate.</a> J. Biol. Chem. 155, 55-70 (1944).</li><li>Lipmann, F., Tuttle, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+micromethod+for+determination+of+acyl+phosphates.">A specific micromethod for determination of acyl phosphates.</a> J. Biol. Chem. 159, 21-28 (1945).</li><li>Lipmann, F., Jones, M. E., Black, S., Flynn, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+the+ATP-CoA-acetate+reaction.">The mechanism of the ATP-CoA-acetate reaction.</a> J. Cell. Physiol. Suppl. 41, 109-112 (1953).</li><li>Rose, I. A., Grunberg-Manago, M., Korey, S. F., Ochoa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+phosphorylation+of+acetate.">Enzymatic phosphorylation of acetate.</a> J. Biol. Chem. 211, 737-756 (1954).</li><li>Allen, S. H., Kellermeyer, R. W., Stjernholm, R. L., Wood, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+properties+of+enzymes+involved+in+the+proponic+acid+fermentation.">Purification and properties of enzymes involved in the proponic acid fermentation.</a> Journal of Bacteriology. 87, 171-187 (1964).</li><li>Clarke, P. M., Payton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzymatic+assay+for+acetate+in+spent+bacterial+culture+supernatants.">An enzymatic assay for acetate in spent bacterial culture supernatants.</a> Anal. Biochem. 130, 402-405 (1983).</li><li>Mukhopadhyay, S., Hasson, M. S., Sanders, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+assay+of+acetate+kinase+activity:+measurement+of+inorganic+phosphate+release+generated+by+hydroxylaminolysis+of+acetyl+phosphate.">A continuous assay of acetate kinase activity: measurement of inorganic phosphate release generated by hydroxylaminolysis of acetyl phosphate.</a> Bioorg. Chem. 36, 65-69 (2008).</li><li>Nakajima, H., Suzuki, K., Imahori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+properties+of+acetate+kinase+from+Bacillus+stearothermophilus.">Purification and properties of acetate kinase from Bacillus stearothermophilus.</a> J. Biochem. 84, 193-203 (1978).</li></ol>

הגילוי של פוספט אצטיל ב assay זה תלוי בריכוז מספיק hydrochloride hydroxylamine ואת ריכוז החומציות של התמיסה כלורי וברזל. שינוי של נפח assay ידרוש בדיקה מחודשת של שני רכיבים אלה. תגובות אנזימטיות המתואר כאן בוצעו על 37 מעלות צלזיוס עם סיום hydroxylamine שבוצעה ב 60 ° C במשך 5 דקות. זו טמפרטורה גבו?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td width="160"> שם מגיב </td><td width="108"> חברה </td><td width="134"> מספר קטלוגי </td><td width="103"> תגובות </td></tr><tr><td> אצטיל פוספט </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> 01409 </td><td> ליתיום מלח (97%) </td></tr><tr><td> סודיום פוספט monobasic (מייבשים) </td><td> ThermoFisher </td><td> S381 </td><td></td></tr><tr><td> סודיום פוספט dibasic (anhydrous) </td><td> ThermoFisher </td><td> S374 </td><td></td></tr><tr><td> מגנזיום כלוריד (hexahydrate) </td><td> ThermoFisher </td><td> M33 </td><td></td></tr><tr><td> מאגר טריס </td><td> ThermoFisher </td><td> B152 </td><td></td></tr><tr><td> כלוריד Ferric (hexahydrate) </td><td> ThermoFisher </td><td> I88 </td><td></td></tr><tr><td> Trichloroacetic חומצה </td><td> ThermoFisher </td><td> A324 </td><td></td></tr><tr><td> Hydroxylamine hydrochloride </td><td> ThermoFisher </td><td> H330 </td><td></td></tr><tr><td> אדנוזין 5&#39;-diphosphate מלח נתרן </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> A2754 </td><td></td></tr><tr><td> Biomate III ספקטרופוטומטר </td><td> ThermoFisher </td><td> 142982082 </td><td> ספקטרופוטומטר תקן UV / Vis </td></tr></table>

direct detection of the acetate-forming activity  of the enzyme acetate kinase

קינאז Acetate, חבר אצטט ו-kinase Hsp70-אקטין סוכר (ASKHA) אנזים superfamily 1-5, אחראי זירחון הפיך של אצטט כדי פוספט אצטיל ניצול ATP כמו המצע. קינאזות Acetate חיידקים נמצאים בכל מקום, נמצא סוג אחד של קדומים, והם נוכחים גם חיידקים של Eukarya 6. קינאז אצטט ביותר מאופיין גם הוא מן מתאן לייצור archaeon Methanosarcina thermophila 7-14. קינאז אצטט אשר יכול לנצל רק PP i-ATP, אך לא בכיוון אצטיל פוספט יוצרי כבר מבודד Entamoeba histolytica, הסוכן סיבתי של דיזנטריה אמבית, ויש לו עד כה נמצאו רק 15,16 הסוג הזה. בכיוון של היווצרות אצטיל פוספט, פעילות קינאז אצטט נמדדת בדרך כלל באמצעות assay hydroxamate, שתוארה לראשונה על ידי ליפמן17-20, assay מצמידים שבו ההמרה של ה-ATP ל ADP היא מצמידים את החמצון של NADH ל NAD + ע&quot;י קינאז האנזימים pyruvate ו לקטט דהידרוגנז 21,22, או מדידה assay שחרורו של פוספטים אנאורגניים אחרי התגובה של המוצר פוספט אצטיל עם hydroxylamine 23. פעילות ההיפך, אצטט יוצרי כיוון נמדד על ידי צימוד היווצרות ATP מ - ADP לצמצום NADP + ל NADPH ידי hexokinase האנזימים וגלוקוז 6 פוספט דהידרוגנז 24. כאן אנו מתארים שיטה לגילוי של פעילות קינאז אצטט לכיוון היווצרות אצטט שאינו דורש צימוד אנזימים, אך הוא מבוסס על נחישות במקום ישירה של צריכת פוספט אצטיל. לאחר התגובה האנזימטית, פוספט אצטיל הנותרים מומר קומפלקס hydroxamate וברזל כי ניתן למדוד spectrophotometrically, כמו assay hydroxamate. לכן, בניגוד רחובassay מצמידים אנדאר עבור בכיוון הזה תלויה ייצור ATP מ - ADP, assay הזה ישיר יכול לשמש קינאזות אצטט המייצרים ATP או PP אני.

Watch this Scientific Journal Video about Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase at JoVE.com

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

שיטה להגדרה של פעילות קינאז אצטט מתואר. Assay זה מנצל תגובה ישירה לקביעת פעילות האנזים ועל קינטיקה של קינאז אצטט בכיוון אצטט יוצרי עם acceptors phosphoryl שונים. יתר על כן, שיטה זו יכולה להיות מנוצל עבור assaying פוספט אצטיל אחרים או אצטיל-CoA אנזימים ניצול.

זיהוי ישיר של פעילות Acetate יוצרי של קינאז Acetate אנזימים

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of Protein Ubiquitination

זיהוי של חלבון Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

שימוש בערכת איתור פלורסנט פרוטאז לקבוע פעילות פרוטאז

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Method for Mycotoxin Detection

ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection

ELIME (אנזימים מקושרים חיסונית מגנטי אלקטרוכימי) שיטת איתור Mycotoxin

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

הפקה של טראנסגנטי Xenopus laevis על ידי שילוב אנזימים מתווכת הגבלת והשתלות גרעיני

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

זיהוי של תחמוצת החנקן אניון קיצוני superoxide ידי ספקטרוסקופיה פאראמגנטיים אלקטרונים תהודה בין תאים באמצעות מלכודות ספין

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

ניטור פעילות קינאז ו phosphatase דרך מחזור התא על ידי Ratiometric סריג

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Assaying פעילות קינאז של LRRK2 במבחנה</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

GC-based Detection of Aldononitrile Acetate Derivatized Glucosamine and Muramic Acid for Microbial Residue Determination in Soil

GC מבוסס זיהוי של אצטט חומצה Aldononitrile גלוקוזאמין Muramic Derivatized לקביעת שאריות מיקרוביאלית בקרקע

Quantitative approaches to characterizing microorganisms are crucial for a broader understanding of the microbial status and function within ecosystems. ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

מדידה של הזחל פעילות ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; צג פעילות

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito

חקר הפעילות של נוירופפטידים ורגולטורים אחרים של מערכת ההפרשה יתוש למבוגרים

Studies of insect physiology, particularly in those species that are vectors of pathogens causing disease in humans and other vertebrates, provide the ...