यह काम NSF 0920274 # पुरस्कार और दक्षिण कैरोलिना प्रयोग स्टेशन (एससी 1,700,340) परियोजना KSS के द्वारा समर्थित किया गया था. इस कागज तकनीकी योगदान सं 5929 Clemson विश्वविद्यालय प्रयोग स्टेशन के.

इस प्रोटोकॉल के समग्र योजना चित्रा 1 में उल्लिखित है. 1. मानक घटता और Assays के लिए समाधान तैयार <ol><li> 2 hydroxylamine - एचसीएल के समाधान / mol एल के 100 एमएल तैयार. Hydroxylamine हाइड्रोक्लोराइड के 13.9 ग्राम (मेगावाट 69.49 छ / mol) वज?...

<ol>
	<li>Bork, P., Sander, C., Valencia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ATPase+domain+common+to+prokaryotic+cell+cycle+proteins,+sugar+kinases,+actin,+and+hsp70+heat+shock+proteins.">An ATPase domain common to prokaryotic cell cycle proteins, sugar kinases, actin, and hsp70 heat shock proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 7290-7294 (1992).</li><li>Bork, P., Sander, C., Valencia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+evolution+of+similar+enzymatic+function+on+different+protein+folds:+the+hexokinase,+ribokinase,+and+galactokinase+families+of+sugar+kinases.">Convergent evolution of similar enzymatic function on different protein folds: the hexokinase, ribokinase, and galactokinase families of sugar kinases.</a> Protein Sci. 2, 31-40 (1993).</li><li>Buss, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urkinase:+structure+of+acetate+kinase,+a+member+of+the+ASKHA+superfamily+of+phosphotransferases.">Urkinase: structure of acetate kinase, a member of the ASKHA superfamily of phosphotransferases.</a> J. Bacteriol. 183, 680-686 (2001).</li><li>Hurley, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sugar+kinase/heat+shock+protein+70/actin+superfamily:+implications+of+conserved+structure+for+mechanism.">The sugar kinase/heat shock protein 70/actin superfamily: implications of conserved structure for mechanism.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 25, 137-162 (1996).</li><li>Holmes, K. C., Sander, C., Valencia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+ATP-binding+fold+in+actin,+hexokinase+and+Hsc70.">A new ATP-binding fold in actin, hexokinase and Hsc70.</a> Trends. Cell. Biol. 3, 53-59 (1993).</li><li>Ingram-Smith, C., Martin, S. R., Smith, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetate+kinase:+not+just+a+bacterial+enzyme.">Acetate kinase: not just a bacterial enzyme.</a> Trends. Microbiol. 14, 249-253 (2006).</li><li>Aceti, D. J., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+acetate+kinase+from+acetate-grown+Methanosarcina+thermophila.+Evidence+for+regulation+of+synthesis.">Purification and characterization of acetate kinase from acetate-grown Methanosarcina thermophila. Evidence for regulation of synthesis.</a> J. Biol. Chem. 263, 15444-15448 (1988).</li><li>Latimer, M. T., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning,+sequence+analysis,+and+hyperexpression+of+the+genes+encoding+phosphotransacetylase+and+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila.">Cloning, sequence analysis, and hyperexpression of the genes encoding phosphotransacetylase and acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Bacteriol. 175, 6822-6829 (1993).</li><li>Ingram-Smith, C., Barber, R. D., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+histidines+in+the+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila.">The role of histidines in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 275, 33765-33770 (2000).</li><li>Miles, R. D., Iyer, P. P., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-directed+mutational+analysis+of+active+site+residues+in+the+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila.">Site-directed mutational analysis of active site residues in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 276, 45059-45064 (2001).</li><li>Miles, R. D., Gorrell, A., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+transition+state+analog,+MgADP-aluminum+fluoride-acetate,+in+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila.">Evidence for a transition state analog, MgADP-aluminum fluoride-acetate, in acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 277, 22547-22552 (2002).</li><li>Ingram-Smith, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+acetate+binding+pocket+in+the+Methanosarcina+thermophila+acetate+kinase.">Characterization of the acetate binding pocket in the Methanosarcina thermophila acetate kinase.</a> J. Bacteriol. 187, 2386-2394 (2005).</li><li>Gorrell, A., Lawrence, S. H., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+kinetic+analyses+of+arginine+residues+in+the+active+site+of+the+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila.">Structural and kinetic analyses of arginine residues in the active site of the acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 280, 10731-10742 (2005).</li><li>Gorrell, A., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+Methanosarcina+thermophila+acetate+kinase+mechanism+by+fluorescence+quenching.">Investigation of the Methanosarcina thermophila acetate kinase mechanism by fluorescence quenching.</a> Biochemistry. 46, 14170-14176 (2007).</li><li>Reeves, R. E., Guthrie, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetate+kinase+(pyrophosphate).+A+fourth+pyrophosphate-dependent+kinase+from+Entamoeba+histolytica.">Acetate kinase (pyrophosphate). A fourth pyrophosphate-dependent kinase from Entamoeba histolytica.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 66, 1389-1395 (1975).</li><li>Fowler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+and+structural+characterization+of+the+novel+PPi-dependent+acetate+kinase+from+the+parasite+Entamoeba+histolytica.">Kinetic and structural characterization of the novel PPi-dependent acetate kinase from the parasite Entamoeba histolytica.</a> , (2011).</li><li>Lipmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+synthesis+of+acetyl+phosphate.">Enzymatic synthesis of acetyl phosphate.</a> J. Biol. Chem. 155, 55-70 (1944).</li><li>Lipmann, F., Tuttle, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+micromethod+for+determination+of+acyl+phosphates.">A specific micromethod for determination of acyl phosphates.</a> J. Biol. Chem. 159, 21-28 (1945).</li><li>Lipmann, F., Jones, M. E., Black, S., Flynn, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+the+ATP-CoA-acetate+reaction.">The mechanism of the ATP-CoA-acetate reaction.</a> J. Cell. Physiol. Suppl. 41, 109-112 (1953).</li><li>Rose, I. A., Grunberg-Manago, M., Korey, S. F., Ochoa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+phosphorylation+of+acetate.">Enzymatic phosphorylation of acetate.</a> J. Biol. Chem. 211, 737-756 (1954).</li><li>Allen, S. H., Kellermeyer, R. W., Stjernholm, R. L., Wood, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+properties+of+enzymes+involved+in+the+proponic+acid+fermentation.">Purification and properties of enzymes involved in the proponic acid fermentation.</a> Journal of Bacteriology. 87, 171-187 (1964).</li><li>Clarke, P. M., Payton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzymatic+assay+for+acetate+in+spent+bacterial+culture+supernatants.">An enzymatic assay for acetate in spent bacterial culture supernatants.</a> Anal. Biochem. 130, 402-405 (1983).</li><li>Mukhopadhyay, S., Hasson, M. S., Sanders, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+assay+of+acetate+kinase+activity:+measurement+of+inorganic+phosphate+release+generated+by+hydroxylaminolysis+of+acetyl+phosphate.">A continuous assay of acetate kinase activity: measurement of inorganic phosphate release generated by hydroxylaminolysis of acetyl phosphate.</a> Bioorg. Chem. 36, 65-69 (2008).</li><li>Nakajima, H., Suzuki, K., Imahori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+properties+of+acetate+kinase+from+Bacillus+stearothermophilus.">Purification and properties of acetate kinase from Bacillus stearothermophilus.</a> J. Biochem. 84, 193-203 (1978).</li></ol>

इस परख में एसिटाइल फॉस्फेट का पता लगाने के hydroxylamine हाइड्रोक्लोराइड की एक पर्याप्त एकाग्रता और एकाग्रता और ferric क्लोराइड समाधान के अम्लता पर निर्भर है. परख मात्रा का परिवर्तन इन दोनों घटकों के पुनर्विचार ?...

<table border="1"><tr><td width="160"> अभिकर्मक के नाम </td><td width="108"> कंपनी </td><td width="134"> सूचीपत्र संख्या </td><td width="103"> टिप्पणियाँ </td></tr><tr><td> Acetyl फॉस्फेट </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> 01409 </td><td> लिथियम नमक (97%) </td></tr><tr><td> सोडियम फॉस्फेट एक भस्मक (निर्जलीकरण) </td><td> ThermoFisher </td><td> S381 </td><td></td></tr><tr><td> सोडियम फॉस्फेट द्विक्षारकीय (निर्जल) </td><td> ThermoFisher </td><td> S374 </td><td></td></tr><tr><td> मैगनीशियम क्लोराइड (hexahydrate) </td><td> ThermoFisher </td><td> M33 </td><td></td></tr><tr><td> Tris बेस </td><td> ThermoFisher </td><td> B152 </td><td></td></tr><tr><td> Ferric क्लोराइड (hexahydrate) </td><td> ThermoFisher </td><td> I88 </td><td></td></tr><tr><td> Trichloroacetic एसिड </td><td> ThermoFisher </td><td> A324 </td><td></td></tr><tr><td> Hydroxylamine हाइड्रोक्लोराइड </td><td> ThermoFisher </td><td> H330 </td><td></td></tr><tr><td> 5&#39;-diphosphate Adenosine सोडियम नमक </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> A2754 </td><td></td></tr><tr><td> Biomate III के स्पेक्ट्रोफोटोमीटर </td><td> ThermoFisher </td><td> 142982082 </td><td> मानक यूवी विज़ / स्पेक्ट्रोफोटोमीटर </td></tr></table>

direct detection of the acetate-forming activity  of the enzyme acetate kinase

एसीटेट kinase, एसीटेट और चीनी kinase HSP70 actin (ASKHA) एंजाइम 1-5 superfamily के एक सदस्य, एसीटेट की प्रतिवर्ती एसिटाइल फॉस्फेट की phosphorylation एक सब्सट्रेट के रूप में एटीपी उपयोग के लिए जिम्मेदार है. एसीटेट kinases बैक्टीरिया में सर्वव्यापक, Archaea का एक जीनस में पाया है, और भी 6 Eukarya के रोगाणुओं में मौजूद हैं . सबसे अच्छी तरह से विशेषता एसीटेट kinase है कि मीथेन उत्पादन archaeon Methanosarcina thermophila 7-14 से. एक एसीटेट kinase जो केवल पीपी मैं का उपयोग कर सकते हैं लेकिन फॉस्फेट के गठन दिशा एसिटाइल में एटीपी नहीं एटामोइबा हिस्टोलिटिका, अमीबी पेचिश की प्रेरणा का एजेंट से पृथक किया गया है, और इस प्रकार अब तक केवल इस जीनस 15,16 में पाया गया है . एसिटाइल फॉस्फेट के गठन की दिशा में, एसीटेट kinase गतिविधि आमतौर पर hydroxamate परख का उपयोग मापा जाता है, पहले Lipmann द्वारा वर्णित17-20, मिलकर परख जिसमें एटीपी के ADP के लिए रूपांतरण NADH के NAD ऑक्सीकरण के लिए युग्मित है + एंजाइमों पाइरूवेट kinase और लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज 21,22 द्वारा, या एक एसिटाइल फॉस्फेट उत्पाद की प्रतिक्रिया के बाद अकार्बनिक फॉस्फेट की रिहाई को मापने परख 23 hydroxylamine साथ. विपरीत में गतिविधि, एसीटेट बनाने दिशा ADP से NADP की कमी + एंजाइमों hexokinase और ग्लूकोज 6 फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज 24 द्वारा NADPH एटीपी गठन युग्मन द्वारा मापा जाता है. यहाँ हम एसीटेट कि युग्मन एंजाइमों की आवश्यकता नहीं है एसीटेट गठन की दिशा में kinase गतिविधि का पता लगाने के के लिए एक विधि का वर्णन है, लेकिन बजाय एसिटाइल फॉस्फेट की खपत के प्रत्यक्ष निर्धारण के आधार पर. Enzymatic प्रतिक्रिया के बाद, शेष एसिटाइल फॉस्फेट ferric hydroxamate जटिल है कि spectrophotometrically hydroxamate परख के लिए के रूप में मापा जा सकता है है के लिए बदल जाती है. इस प्रकार, सेंट विपरीतADP से एटीपी के उत्पादन पर निर्भर है कि इस दिशा के लिए andard मिलकर परख, इस सीधे परख एसीटेट kinases है कि एटीपी या पीपी मैं उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

एसीटेट kinase गतिविधि के निर्धारण के लिए एक विधि का वर्णन है. इस परख एसीटेट के गठन की दिशा में विभिन्न phosphoryl स्वीकारकर्ताओं के साथ एंजाइम और एसीटेट kinase की गतिविधि कैनेटीक्स का निर्धारण करने के लिए एक सीधा प्रतिक्रिया का इस्तेमाल करता. इसके अलावा, इस पद्धति अन्य एसिटाइल फॉस्फेट या एंजाइमों acetyl-CoA उपयोग परख करने की क्रिया के लिए उपयोग किया जा सकता है.

एनजाइम एसीटेट kinase की गतिविधि एसीटेट बनाने की सीधी जांच

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

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