Este trabajo fue apoyado por el premio NSF # 0920274 y Carolina del Sur de la Estación Experimental del proyecto (SC-1700340) para KSS. Este documento es el N º 5929 Contribución Técnica de la Estación Experimental de la Universidad de Clemson.

El esquema general de este protocolo se describe en la figura 1. 1. Preparación para la solución de las curvas de calibración y ensayos <ol><li> Preparar 100 ml de una 2 mol / L de hidroxilamina-HCl. Pesar 13,9 g de clorhidrato de hidroxilamina (MW 69,49 g / mol) y se disuelven en aproximadamente 50 ml de agua destilada, agua desionizada (DDC 2 O). Ajustar el pH a 7.0 con pellets de hidróxido de potasio o una solución concentrada. Llevar el volumen final de 100 ml. La soluc...

<ol>
	<li>Bork, P., Sander, C., Valencia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ATPase+domain+common+to+prokaryotic+cell+cycle+proteins,+sugar+kinases,+actin,+and+hsp70+heat+shock+proteins.">An ATPase domain common to prokaryotic cell cycle proteins, sugar kinases, actin, and hsp70 heat shock proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 7290-7294 (1992).</li><li>Bork, P., Sander, C., Valencia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+evolution+of+similar+enzymatic+function+on+different+protein+folds:+the+hexokinase,+ribokinase,+and+galactokinase+families+of+sugar+kinases.">Convergent evolution of similar enzymatic function on different protein folds: the hexokinase, ribokinase, and galactokinase families of sugar kinases.</a> Protein Sci. 2, 31-40 (1993).</li><li>Buss, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urkinase:+structure+of+acetate+kinase,+a+member+of+the+ASKHA+superfamily+of+phosphotransferases.">Urkinase: structure of acetate kinase, a member of the ASKHA superfamily of phosphotransferases.</a> J. Bacteriol. 183, 680-686 (2001).</li><li>Hurley, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sugar+kinase/heat+shock+protein+70/actin+superfamily:+implications+of+conserved+structure+for+mechanism.">The sugar kinase/heat shock protein 70/actin superfamily: implications of conserved structure for mechanism.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 25, 137-162 (1996).</li><li>Holmes, K. C., Sander, C., Valencia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+ATP-binding+fold+in+actin,+hexokinase+and+Hsc70.">A new ATP-binding fold in actin, hexokinase and Hsc70.</a> Trends. Cell. Biol. 3, 53-59 (1993).</li><li>Ingram-Smith, C., Martin, S. R., Smith, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetate+kinase:+not+just+a+bacterial+enzyme.">Acetate kinase: not just a bacterial enzyme.</a> Trends. Microbiol. 14, 249-253 (2006).</li><li>Aceti, D. J., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+acetate+kinase+from+acetate-grown+Methanosarcina+thermophila.+Evidence+for+regulation+of+synthesis.">Purification and characterization of acetate kinase from acetate-grown Methanosarcina thermophila. Evidence for regulation of synthesis.</a> J. Biol. Chem. 263, 15444-15448 (1988).</li><li>Latimer, M. T., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning,+sequence+analysis,+and+hyperexpression+of+the+genes+encoding+phosphotransacetylase+and+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila.">Cloning, sequence analysis, and hyperexpression of the genes encoding phosphotransacetylase and acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Bacteriol. 175, 6822-6829 (1993).</li><li>Ingram-Smith, C., Barber, R. D., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+histidines+in+the+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila.">The role of histidines in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 275, 33765-33770 (2000).</li><li>Miles, R. D., Iyer, P. P., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-directed+mutational+analysis+of+active+site+residues+in+the+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila.">Site-directed mutational analysis of active site residues in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 276, 45059-45064 (2001).</li><li>Miles, R. D., Gorrell, A., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+transition+state+analog,+MgADP-aluminum+fluoride-acetate,+in+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila.">Evidence for a transition state analog, MgADP-aluminum fluoride-acetate, in acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 277, 22547-22552 (2002).</li><li>Ingram-Smith, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+acetate+binding+pocket+in+the+Methanosarcina+thermophila+acetate+kinase.">Characterization of the acetate binding pocket in the Methanosarcina thermophila acetate kinase.</a> J. Bacteriol. 187, 2386-2394 (2005).</li><li>Gorrell, A., Lawrence, S. H., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+kinetic+analyses+of+arginine+residues+in+the+active+site+of+the+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila.">Structural and kinetic analyses of arginine residues in the active site of the acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 280, 10731-10742 (2005).</li><li>Gorrell, A., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+Methanosarcina+thermophila+acetate+kinase+mechanism+by+fluorescence+quenching.">Investigation of the Methanosarcina thermophila acetate kinase mechanism by fluorescence quenching.</a> Biochemistry. 46, 14170-14176 (2007).</li><li>Reeves, R. E., Guthrie, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetate+kinase+(pyrophosphate).+A+fourth+pyrophosphate-dependent+kinase+from+Entamoeba+histolytica.">Acetate kinase (pyrophosphate). A fourth pyrophosphate-dependent kinase from Entamoeba histolytica.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 66, 1389-1395 (1975).</li><li>Fowler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+and+structural+characterization+of+the+novel+PPi-dependent+acetate+kinase+from+the+parasite+Entamoeba+histolytica.">Kinetic and structural characterization of the novel PPi-dependent acetate kinase from the parasite Entamoeba histolytica.</a> , (2011).</li><li>Lipmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+synthesis+of+acetyl+phosphate.">Enzymatic synthesis of acetyl phosphate.</a> J. Biol. Chem. 155, 55-70 (1944).</li><li>Lipmann, F., Tuttle, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+micromethod+for+determination+of+acyl+phosphates.">A specific micromethod for determination of acyl phosphates.</a> J. Biol. Chem. 159, 21-28 (1945).</li><li>Lipmann, F., Jones, M. E., Black, S., Flynn, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+the+ATP-CoA-acetate+reaction.">The mechanism of the ATP-CoA-acetate reaction.</a> J. Cell. Physiol. Suppl. 41, 109-112 (1953).</li><li>Rose, I. A., Grunberg-Manago, M., Korey, S. F., Ochoa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+phosphorylation+of+acetate.">Enzymatic phosphorylation of acetate.</a> J. Biol. Chem. 211, 737-756 (1954).</li><li>Allen, S. H., Kellermeyer, R. W., Stjernholm, R. L., Wood, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+properties+of+enzymes+involved+in+the+proponic+acid+fermentation.">Purification and properties of enzymes involved in the proponic acid fermentation.</a> Journal of Bacteriology. 87, 171-187 (1964).</li><li>Clarke, P. M., Payton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzymatic+assay+for+acetate+in+spent+bacterial+culture+supernatants.">An enzymatic assay for acetate in spent bacterial culture supernatants.</a> Anal. Biochem. 130, 402-405 (1983).</li><li>Mukhopadhyay, S., Hasson, M. S., Sanders, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+assay+of+acetate+kinase+activity:+measurement+of+inorganic+phosphate+release+generated+by+hydroxylaminolysis+of+acetyl+phosphate.">A continuous assay of acetate kinase activity: measurement of inorganic phosphate release generated by hydroxylaminolysis of acetyl phosphate.</a> Bioorg. Chem. 36, 65-69 (2008).</li><li>Nakajima, H., Suzuki, K., Imahori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+properties+of+acetate+kinase+from+Bacillus+stearothermophilus.">Purification and properties of acetate kinase from Bacillus stearothermophilus.</a> J. Biochem. 84, 193-203 (1978).</li></ol>

La detección de acetil fosfato en este ensayo depende de una suficiente concentración de clorhidrato de hidroxilamina y la concentración y la acidez de la solución de cloruro férrico. Alteración del volumen de ensayo requiere la reconsideración de estos dos componentes. Las reacciones enzimáticas que se describe aquí se realizaron a 37 ° C con la terminación hidroxilamina realiza a 60 ° C durante 5 minutos. Esta temperatura más alta es fundamental para permitir la rápida transformación de la acetil fosfat...

<table border="1"><tr><td width="160"> Nombre del reactivo </td><td width="108"> Empresa </td><td width="134"> Número de catálogo </td><td width="103"> Comentarios </td></tr><tr><td> Acetil fosfato </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 01409 </td><td> La sal de litio (97%) </td></tr><tr><td> Fosfato de sodio monobásico (deshidratación) </td><td> ThermoFisher </td><td> S381 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato de sodio dibásico (anhidro) </td><td> ThermoFisher </td><td> S374 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro de magnesio (hexahidratado) </td><td> ThermoFisher </td><td> M33 </td><td></td></tr><tr><td> Tris Base </td><td> ThermoFisher </td><td> B152 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro férrico (hexahidratado) </td><td> ThermoFisher </td><td> I88 </td><td></td></tr><tr><td> El ácido tricloroacético </td><td> ThermoFisher </td><td> A324 </td><td></td></tr><tr><td> Hidroxilamina hidrocloruro </td><td> ThermoFisher </td><td> H330 </td><td></td></tr><tr><td> 5&#39;-difosfato de adenosina sal de sodio </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A2754 </td><td></td></tr><tr><td> BIOMATE III Espectrofotómetro </td><td> ThermoFisher </td><td> 142982082 </td><td> Estándar de UV / Vis espectrofotómetro </td></tr></table>

direct detection of the acetate-forming activity  of the enzyme acetate kinase

Quinasa de acetato, un miembro del acetato y el azúcar-quinasa Hsp70-actina (ASKHA) superfamilia de enzimas 1-5, es el responsable de la fosforilación reversible de acetato de acetil fosfato que utilizan ATP como sustrato. Acetato de quinasas son muy abundantes en las bacterias, que se encuentra en un género de Archaea, y también están presentes en los microbios de la Eukarya 6. El acetato quinasa mejor caracterizados es que a partir del metano que producen thermophila archaeon Methanosarcina 14.07. Una quinasa acetato de que sólo se puede utilizar PP i ATP, pero no en la dirección de la acetil-fosfato forman se ha aislado de Entamoeba histolytica, el agente causante de la disentería amebiana, y hasta el momento sólo se han encontrado en este género 15,16. En la dirección de la formación de acetil fosfato, acetato de actividad quinasa se mide típicamente usando el ensayo de hidroxamato, describió por primera vez por Lipmann17-20, un ensayo acoplado en lo que se suma la conversión de ATP a ADP a la oxidación de NADH a NAD + por la piruvato quinasa enzimas lactato deshidrogenasa y 21,22, o un ensayo de medición de la liberación de fosfato inorgánico después de la reacción del producto acetil fosfato con hidroxilamina 23. Actividad en la dirección opuesta, el acetato de formación de la dirección se mide mediante el acoplamiento de la formación de ATP a partir de ADP a la reducción de NADP + a NADPH por las enzimas hexoquinasa y glucosa 6-fosfato deshidrogenasa 24. Aquí se describe un método para la detección de la actividad quinasa de acetato en la dirección de la formación de acetato que no requiere de enzimas de acoplamiento, sino que se basa en la determinación directa del consumo de acetil fosfato. Después de la reacción enzimática, fosfato restante acetil se convierte en un complejo hidroxamato férrico que se puede medir espectrofotométricamente, como para el ensayo de hidroxamato. Por lo tanto, a diferencia del stensayo andard junto a esta dirección, que depende de la producción de ATP a partir de ADP, este ensayo directo se pueden utilizar para las quinasas de acetato que producen ATP o PP i.

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Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

Un método para la determinación de la actividad quinasa de acetato se describe. Este ensayo utiliza una reacción directa para determinar la actividad enzimática y la cinética de la cinasa de acetato en la dirección de acetato de formación con diferentes aceptores fosforilo. Además, este método puede ser utilizado para el ensayo de fosfato de otros o acetil de acetil-CoA utilizando enzimas.

La detección directa de la actividad de acetato de formación de la enzima cinasa de acetato

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

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