Name: rnai-mediated gene knockdown and in vivo diuresis assay in adult female aedes aegypti mosquitoes
Uploaded: 2012-07-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes at JoVE.com

Les auteurs tiennent à remercier Victoria Carpenter pour ses commentaires critiques de ce protocole.

Partie I - inactivation génique médiée par ARNi dans les moustiques adultes, Aedes aegypti. Pour un aperçu expérience voir la figure 1. 1. Synthèse ARNdb <ol><li> Synthétiser ARNdb spécifiques contre les gènes de ARNdb d&#39;intérêt et de contrôle. Remarque: Nous recommandons amorces développement pour les fragments PCR de l&#39;ordre de 300 à 500 paires de bases situées à l&#39;extrémité 3 &#39;de la 2 ADNc spécifique et avec la séquen...

<ol>
	<li>Drake, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aquaporin+gene+family+of+the+yellow+fever+mosquito,+Aedes+aegypti.">The Aquaporin gene family of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti.</a> PloS one. 5, e15578 (2010).</li><li>Shepard, A. R., Jacobson, N., Clark, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+quantitative+PCR+primer+location+for+short+interfering+RNA+efficacy+determination.">Importance of quantitative PCR primer location for short interfering RNA efficacy determination.</a> Analytical biochemistry. 344, 287-288 (2005).</li><li>Altschul, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gapped+BLAST+and+PSI-BLAST:+a+new+generation+of+protein+database+search+programs.">Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs.</a> Nucleic acids research. 25, 3389-3402 (1997).</li><li>Garver, L., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+RNAi+Assays+in+Adult+Mosquitoes+(A.+gambiae).">Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae).</a> J. Vis. Exp. (5), e230 (2007).</li><li>Clements, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volume+1+Development,+Nutrition,+and+Reproduction.">Volume 1 Development, Nutrition, and Reproduction.</a> The Biology of Mosquitoes. 2, (1992).</li><li>Hansen, I. A., Attardo, G. M., Park, J. H., Peng, Q., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+of+rapamycin-mediated+amino+acid+signaling+in+mosquito+anautogeny.">Target of rapamycin-mediated amino acid signaling in mosquito anautogeny.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 10626-10631 (2004).</li><li>Hansen, I. A., Attardo, G. M., Roy, S. G., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+of+rapamycin-dependent+activation+of+S6+kinase+is+a+central+step+in+the+transduction+of+nutritional+signals+during+egg+development+in+a+mosquito.">Target of rapamycin-dependent activation of S6 kinase is a central step in the transduction of nutritional signals during egg development in a mosquito.</a> The Journal of biological chemistry. 280, 20565-20572 (2005).</li><li>Pannabecker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+the+Malpighian+Tubule.">Physiology of the Malpighian Tubule.</a> Annual review of entomology. 40, 493-510 (1995).</li><li>Dow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+Malpighian+tubule+function+from+functional+genomics.">New insights into Malpighian tubule function from functional genomics.</a> Comp Biochem Phys A. 150, S135 (2008).</li><li>Dow, J. A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+Malpighian+tubule+from+functional+genomics.">Insights into the Malpighian tubule from functional genomics.</a> Journal of Experimental Biology. 212, 435-445 (2009).</li><li>Lawson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VectorBase:+a+data+resource+for+invertebrate+vector+genomics.">VectorBase: a data resource for invertebrate vector genomics.</a> Nucleic acids research. 37, 583-587 (2009).</li><li>Beyenbach, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+mechanisms+of+diuresis+in+Malpighian+tubules+of+insects.">Transport mechanisms of diuresis in Malpighian tubules of insects.</a> J. Exp. Biol. 206 (Pt 21), 3845-3856 (2003).</li><li>Coast, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+recording+of+excretory+water+loss+from+Musca+domestica+using+a+flow-through+humidity+meter:+hormonal+control+of+diuresis.">Continuous recording of excretory water loss from Musca domestica using a flow-through humidity meter: hormonal control of diuresis.</a> Journal of insect physiology. 50, 455-468 (2004).</li><li>Kersch, C. N., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+Aedes+aegypti+(L.)+leucokinin+receptor+is+critical+for+in+vivo+fluid+excretion+post+blood+feeding.">Mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is critical for in vivo fluid excretion post blood feeding.</a> FEBS letters. 585, 3507-3512 (2011).</li><li>Hays, A. R., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+protein+produced+by+the+vitellogenic+fat+body+and+accumulated+in+mosquito+oocytes.">A novel protein produced by the vitellogenic fat body and accumulated in mosquito oocytes.</a> Development Genes and Evolution. 199, 114-121 (1990).</li></ol>

Le protocole utilisé ARNi a été développé dans le laboratoire d&#39;Alexandre Raikhel à l&#39;Université de Californie Riverside 6,7 et est semblable à un protocole publié par Garver et Dimopoulos 4. L&#39;approche expérimentale montré dans ce protocole vidéo peut être utilisée pour étudier les gènes impliqués dans la diurèse des insectes dans un cadre en vivo. Les organes excréteurs des insectes, les tubes de Malpighi, ont attiré l&#39;intérêt des générations de ch...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif ou de l&#39;équipement </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 Kit High Yield </td><td> Ambion, Inc </td><td> AM1334 </td><td></td></tr><tr><td> Tampon PBS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4417 </td><td></td></tr><tr><td> Tubes en plastique </td><td> Fournisseur local </td><td></td><td> PVC </td></tr><tr><td> 1 ml en plastique pointe de pipette </td><td> VWR </td><td> 83007-376 </td><td> Embout bleu </td></tr><tr><td> Seringue de 1 ml </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> 309602 </td><td></td></tr><tr><td> Ciseaux </td><td> Fournisseur local </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Aiguille métallique </td><td> Caroline Biologicals </td><td> 654307 </td&gt; <td> Taille 5 </td></tr><tr><td> Fly pad </td><td> Genesee scientifique </td><td> 789060 </td><td></td></tr><tr><td> Alimenté par batterie aspirateur w / collection flacon </td><td> Labs UPMA </td><td> IPMM 2000 </td><td></td></tr><tr><td> Pince pointe fine </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> 14095 </td><td></td></tr><tr><td> Aiguilles capillaires en verre pour </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> 1B200-6 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope à dissection stéréo </td><td> Leica Microsystems </td><td> S6D </td><td></td></tr><tr><td> Balance de précision analytique </td><td> Mettler Toledo </td><td> AB54S </td><td></td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 84097 </td><td></td></tr><tr><td> Un demi-litre ciré tasses en carton doublés </td><td> Fournisseur local </td><td></td><td> Tasses à soupe Fabricant </td></tr><tr><td> Filet à mailles </td><td> Fournisseur local </td><td></td><td> gaze mouche en plastique </td></tr></tbody></table>

rnai-mediated gene knockdown and in vivo diuresis assay in adult female aedes aegypti mosquitoes

Ce protocole vidéo montre une technique efficace pour effet de choc d&#39;un gène particulier dans un insecte et de mener un essai biologique roman pour mesurer le taux d&#39;excrétion. Cette méthode peut être utilisée pour obtenir une meilleure compréhension du processus de la diurèse chez les insectes et est particulièrement utile dans l&#39;étude de la diurèse dans le sang d&#39;alimentation arthropodes qui sont en mesure de prendre d&#39;énormes quantités de liquide dans un repas de sang unique. Cette inactivation génique médiée par ARNi combiné avec un test in vivo diurèse a été développé par le laboratoire Hansen pour étudier les effets de l&#39;ARNi à médiation knockdown de gènes d&#39;aquaporines sur moustique Aedes aegypti diurèse 1. Le protocole est configuré en deux parties: la première démonstration illustre comment construire un dispositif simple moustique injection et comment préparer et injecter ARNdb dans le thorax de moustiques pour inactivation génique médiée par ARNi. La deuxième démonstration illustre comment déterminerles taux d&#39;excrétion chez les moustiques en utilisant un dosage biologique in vivo.

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RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

Dans ce protocole, nous combinons silencing RNAi-médiée avec un gène<em&gt; In vivo</emDosage diurèse&gt; pour étudier l&#39;effet de choc effets de gènes d&#39;intérêt a sur l&#39;excrétion de liquide moustiques.

Inactivation génique médiée par ARNi et<em&gt; In Vivo</emEssai diurèse&gt; Femmes adultes<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Les moustiques

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

Research

JoVE Journal

Biology

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

Injection of dsRNA into Female A. aegypti Mosquitos

L&#39;injection d&#39;ARNdb dans Femme Mosquitos aegypti A.

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Recherche

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