Name: efficient recombinant parvovirus production with the help of adenovirus-derived systems
Uploaded: 2012-04-23T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems at JoVE.com

نشكر فريق من إنتاج فيروس DKFZ وحدة التطوير، في ماركوس مولر وجه الخصوص، Münstermann سيلفيا، Liebetrau باربارا، وRoscher ماندي. وقد دعمت هذه الدراسة جزئيا من المنح المقدمة من الوزارة الاتحادية للتعليم والبحوث (BMBF) ومؤسسة هيلمهولتس في إطار Krebsforschungszentrum الألماني / Cancéropôle دو غراند مؤسسة برنامج مشترك في الأورام التطبيقية علم الفيروسات.

لاحظ أن هناك حاجة إلى مختبر مع مستوى السلامة الحيوية (2) لإنتاج parvoviruses المؤتلف (recPV). وينقسم هذا البروتوكول في جزئين رئيسيين. مطلوب الجزء الأول (إنتاج recPV عبر ترنسفكأيشن) لإنتاج كمية ضئيلة من recPVs التي هي بمثابة اللقاح في الجزء الثاني...

<ol>
	<li>Cotmore, S. F., Tattersall, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parvoviral+host+range+and+cell+entry+mechanisms.">Parvoviral host range and cell entry mechanisms.</a> Adv. Virus. Res. 70, 183 (2007).</li><li>Rommelaere, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+parvoviruses+as+cancer+therapeutics.">Oncolytic parvoviruses as cancer therapeutics.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 21, 185 (2010).</li><li>Hristov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Through+Its+Nonstructural+Protein+NS1,+Parvovirus+H-1+Induces+Apoptosis+via+Accumulation+of+Reactive+Oxygen+Species.">Through Its Nonstructural Protein NS1, Parvovirus H-1 Induces Apoptosis via Accumulation of Reactive Oxygen Species.</a> J. Virol. 84, 5909-5909 (2010).</li><li>Cornelis, J. J., Salome, N., Dinsart, C., Rommelaere, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vectors+based+on+autonomous+parvoviruses:+novel+tools+to+treat+cancer.">Vectors based on autonomous parvoviruses: novel tools to treat cancer.</a> J. Virol. 6, 193-193 (2004).</li><li>El-Andaloussi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+adenovirus-based+helper+system+to+support+production+of+recombinant+parvovirus.">Novel adenovirus-based helper system to support production of recombinant parvovirus.</a> Cancer Gene Ther. 18, (2011).</li><li>Kestler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cis+requirements+for+the+efficient+production+of+recombinant+DNA+vectors+based+on+autonomous+parvoviruses.">cis requirements for the efficient production of recombinant DNA vectors based on autonomous parvoviruses.</a> Hum. Gene. Ther. 10, 1619-1619 (1999).</li><li>Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+high-titer+recombinant+adeno-associated+virus+vectors+in+the+absence+of+helper+adenovirus.">Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus.</a> J. Virol. 72, 2224 (1998).</li><li>He, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+system+for+generating+recombinant+adenoviruses.">A simplified system for generating recombinant adenoviruses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 2509 (1998).</li><li>Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+adeno-associated+virus+purification+using+novel+methods+improves+infectious+titer+and+yield.">Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield.</a> Gene. Ther. 6, 973 (1999).</li><li>Maxwell, F., Harrison, G. S., Maxwell, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+production+of+recombinant+AAV+by+transient+transfection+of+NB324K+cells+using+electroporation.">Improved production of recombinant AAV by transient transfection of NB324K cells using electroporation.</a> J. Virol. Methods. 63, 129 (1997).</li><li>Wrzesinski, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+and+pseudotyped+parvoviruses+minimize+the+contamination+of+recombinant+stocks+with+replication-competent+viruses+and+identify+a+DNA+sequence+that+restricts+parvovirus+H-1+in+mouse+cells.">Chimeric and pseudotyped parvoviruses minimize the contamination of recombinant stocks with replication-competent viruses and identify a DNA sequence that restricts parvovirus H-1 in mouse cells.</a> J. Virol. 77, 3851 (2003).</li></ol>

لقد أظهرنا أنه يمكن تعزيز recPV الإنتاج من خلال وجود عناصر الجينومية الفيروسة الغدانية. لقد قمنا بزيادة الغلة recPV بأكثر من 10 ضعفا (0،3-5 خلية / TU) من خلال تقديم اتش العنصر الجيني عبر ترنسفكأيشن وأكثر من 100 أضعاف الخلايا المشارك اصابة مع AD-VP-المساعد في تركيبة مع recPV في بالمقار...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> سيغما </td><td> D5796 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> سيغما </td><td> M4655 </td></tr><tr><td> الجنين المصل البقري </td><td> PAA </td><td> A15-101 </td></tr><tr><td> L-الجلوتامين </td><td> Gibco </td><td> 25030-024 </td></tr><tr><td> Fugene </td><td> روش </td><td> 047097050001 </td></tr><tr><td> التربسين-EDTA </td><td> إينفيتروجن </td><td> 25300062 </td></tr><tr><td> Benzonase Nuclease </td><td> سيغما </td><td> E8263 </td></tr><tr><td> الغدة-X السريع العيار الحجمي كيت </td><td> Clontech </td><td> 632250 </td></tr></tbody></table>

efficient recombinant parvovirus production with the help of adenovirus-derived systems

parvoviruses القوارض (PV) مثل جرذ H-1PV وMVM، صغيرة، واحد متعدد السطوح الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي الفيروسات،. الجينوم الخاصة بهم تضم اثنين من المروجين P4 و P38 التي تنظم التعبير عن البروتينات غير الهيكلية (NS1 وNS2)، وقفيصة (VP1 وVP2) على التوالي 1. وهي تجتذب اهتماما كبيرا كعوامل مضادة للسرطان لقدراتهم وoncolytic oncosuppressive في حين يجري غير ممرضة للبشر 2. NS1 هو المستجيب الرئيسية من 3 السمسة الفيروسية. من أجل تعزيز أنشطتها موانع الأورام الطبيعية، وقد ولدت هذه المشتقات من ناقلات عن طريق استبدال الجين الترميز لالبروتينات قفيصة مع التحوير العلاجية (مثل ببتيد السامة للخلايا، خلوى، chemokine الجينات السرطانية، القامع الخ) 4. وparvoviruses المؤتلف (recPVs) ناقلات يحتفظ تسلسل NS1 / 2 الترميز والتيلومير الجينوم الكهروضوئية التي تعتبر ضرورية لتضخيم الحمض النووي الفيروسي والتعبئة والتغليف. إنتاجrecPVs لا يحدث إلا في الخلايا المنتجة (HEK293T عموما)، التي شاركت في transfecting الخلايا مع ناقل الثانية (pCMV-VP) معربا عن ترميز الجين للبروتينات نائب الرئيس (الشكل رقم 1) 4. ناقلات recPV ولدت في هذه الطريقة هي تكرار معيب. على الرغم من أن recPVs ثبت لامتلاك الأنشطة oncotoxic المعززة فيما يتعلق الفيروسات من الوالدين والتي تم إنشاؤها فيها، إنتاجها لا يزال يشكل تحديا كبيرا ويعرقل بشدة استخدام هذه العوامل المضادة للسرطان في التطبيقات السريرية. وجدنا أن إدخال متجه الإعلان-5 المشتقة التي تحتوي على E2A، E4 (orf6) والحمض النووي الريبي الجينات زارة شؤون المحاربين القدامى (على سبيل المثال pXX6 البلازميد) في HEK293T تحسن الإنتاج من recPVs بأكثر من 10 ضعفا بالمقارنة مع غيرها من البروتوكولات في الاستخدام. استنادا إلى هذه النتيجة، لقد وضعنا رواية AD-VP-المساعد الذي يحتوي على العناصر الجينية الفيروسة الغدانية اللازمة لتعزيز الإنتاج recPVs فضلا عن parvovir فيلنا وحدة الجينات نائب الرئيس 5. استخدام AD-VP-المساعد، ويسمح إنتاج تفصيل، المحاضر الحرفية باستخدام بروتوكول الذي يعتمد كليا على خطوات عدوى فيروسية (على العكس من ترنسفكأيشن البلازميد)، مما يجعل من الممكن استخدام خطوط الخلايا التي يصعب transfect (على سبيل المثال NB324K) ( الشكل 2). نقدم أسلوب الذي يحسن كثيرا من كمية الفيروس المؤتلف المنتجة، والحد من كل من وقت الإنتاج والتكاليف، دون التأثير على جودة المنتج النهائي 5. وبالإضافة إلى ذلك، الانتاج على نطاق كبير من recPV (في الخلايا التعليق والمفاعلات الحيوية) هي الآن يمكن تصوره.

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems at JoVE.com

Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

نحن هنا وصفا لبروتوكول يستند فقط على إصابة الخلية، مما يحسن من كفاءة الإنتاج البارفو المؤتلف من قبل أكثر من 100 أضعاف بالمقارنة مع غيرها من البروتوكولات في الاستخدام. هذا البروتوكول يعتمد على استخدام اتش 5 رواية القائم على المساعد الذي يحتوي على نسخ نائب رئيس وحدة البارفو (AD-VP).

كفاءة الإنتاج البارفو المؤتلف مع مساعدة من اتش المستمدة من الأنظمة

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Estimating Virus Production Rates in Aquatic Systems

تقدير معدلات الإنتاج الفيروسات في النظم المائية

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative ...

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

المؤتلف إنتاج فيروسات الرجعية والعدوى من خلايا B

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

بروتوكول الأمثل لترنسفكأيشن كفاءة الخلايا الجذعية من دون نضوج الخلايا

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

إنتاج وناقلات Titering الغدة المؤتلف المرتبطة الفيروسية

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

جيل من الفيروسة الرملية المؤتلف استحداث اللقاحات وافقت عليها الهيئة في خلايا فيرو

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

تحجيم إنتاجية عالية التحديد من المكتبات الأجسام المضادة الاصطناعية-عرض فاجي

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

إنتاج بسيطة وفعالة وتنقية ماوس المايلين دبقية قليلة التغصن البروتين السكري لالتجريبية المناعة الذاتية الدراسات التهاب الدماغ

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

تحليل الخلايا الليمفاوية التسرب باستخدام<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج من الدم في الدماغ الإنسان الحاجز

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

كشف وإزالة التلوث Nuclease أثناء تنقية Integrase فيروس مزبد النموذج المؤتلف

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

توليد نواقل هربس إنفلونزا الطيور المؤتلف مع كريسبر/Cas9 الجينات تحرير

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian ...