Name: efficient recombinant parvovirus production with the help of adenovirus-derived systems
Uploaded: 2012-04-23T12:00:00
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Damos las gracias al equipo de la producción de virus DKFZ y la unidad de desarrollo, en particular, Müller Marcus, Münstermann Silvia, Liebetrau Bárbara, y Roscher Mandy. Este estudio ha sido parcialmente subvencionado por el Ministerio Federal de Educación e Investigación (BMBF) y la Asociación Helmholtz en el marco de la Deutsches Krebsforschungszentrum / Cancéropôle du Grand-Est programa conjunto en el tumor Aplicada Virología.

Nótese que un laboratorio con un nivel de bioseguridad 2 se requiere para la producción de parvovirus recombinantes (recPV). El protocolo se divide en dos partes principales. La primera parte (producción de recPV a través de la transfección) se requiere para producir la cantidad mínima de recPVs que sirve como inóculo en la segunda parte del protocolo (producción de recPVs a través de la infección). Una vez que una pequeña cantidad de recPVs se produce, la primera parte del protoc...

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	<li>Cotmore, S. F., Tattersall, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parvoviral+host+range+and+cell+entry+mechanisms.">Parvoviral host range and cell entry mechanisms.</a> Adv. Virus. Res. 70, 183 (2007).</li><li>Rommelaere, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+parvoviruses+as+cancer+therapeutics.">Oncolytic parvoviruses as cancer therapeutics.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 21, 185 (2010).</li><li>Hristov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Through+Its+Nonstructural+Protein+NS1,+Parvovirus+H-1+Induces+Apoptosis+via+Accumulation+of+Reactive+Oxygen+Species.">Through Its Nonstructural Protein NS1, Parvovirus H-1 Induces Apoptosis via Accumulation of Reactive Oxygen Species.</a> J. Virol. 84, 5909-5909 (2010).</li><li>Cornelis, J. J., Salome, N., Dinsart, C., Rommelaere, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vectors+based+on+autonomous+parvoviruses:+novel+tools+to+treat+cancer.">Vectors based on autonomous parvoviruses: novel tools to treat cancer.</a> J. Virol. 6, 193-193 (2004).</li><li>El-Andaloussi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+adenovirus-based+helper+system+to+support+production+of+recombinant+parvovirus.">Novel adenovirus-based helper system to support production of recombinant parvovirus.</a> Cancer Gene Ther. 18, (2011).</li><li>Kestler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cis+requirements+for+the+efficient+production+of+recombinant+DNA+vectors+based+on+autonomous+parvoviruses.">cis requirements for the efficient production of recombinant DNA vectors based on autonomous parvoviruses.</a> Hum. Gene. Ther. 10, 1619-1619 (1999).</li><li>Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+high-titer+recombinant+adeno-associated+virus+vectors+in+the+absence+of+helper+adenovirus.">Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus.</a> J. Virol. 72, 2224 (1998).</li><li>He, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+system+for+generating+recombinant+adenoviruses.">A simplified system for generating recombinant adenoviruses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 2509 (1998).</li><li>Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+adeno-associated+virus+purification+using+novel+methods+improves+infectious+titer+and+yield.">Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield.</a> Gene. Ther. 6, 973 (1999).</li><li>Maxwell, F., Harrison, G. S., Maxwell, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+production+of+recombinant+AAV+by+transient+transfection+of+NB324K+cells+using+electroporation.">Improved production of recombinant AAV by transient transfection of NB324K cells using electroporation.</a> J. Virol. Methods. 63, 129 (1997).</li><li>Wrzesinski, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+and+pseudotyped+parvoviruses+minimize+the+contamination+of+recombinant+stocks+with+replication-competent+viruses+and+identify+a+DNA+sequence+that+restricts+parvovirus+H-1+in+mouse+cells.">Chimeric and pseudotyped parvoviruses minimize the contamination of recombinant stocks with replication-competent viruses and identify a DNA sequence that restricts parvovirus H-1 in mouse cells.</a> J. Virol. 77, 3851 (2003).</li></ol>

Hemos demostrado que la producción recPV puede mejorarse por la presencia de elementos genómicos adenovirales. Hemos aumentado los rendimientos recPV por más de 10 veces (de 0,3 a 5 UT / célula), proporcionando elemento adenovirus genómico a través de la transfección y por más de 100 veces infectan co-las células con Ad-VP-ayudante en combinación con el recPV en comparación con los protocolos convencionales. El protocolo descrito aquí puede optimizarse mediante la determinación de la temporización más ade...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma </td><td> D5796 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Sigma </td><td> M4655 </td></tr><tr><td> Suero bovino fetal </td><td> PAA </td><td> A15-101 </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Gibco </td><td> 25030-024 </td></tr><tr><td> Fugene </td><td> Roche </td><td> 047097050001 </td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25300062 </td></tr><tr><td> Benzonase nucleasa </td><td> Sigma </td><td> E8263 </td></tr><tr><td> Adeno-X rápida Titulación Kit </td><td> Clontech </td><td> 632250 </td></tr></tbody></table>

efficient recombinant parvovirus production with the help of adenovirus-derived systems

Parvovirus roedores (PV), tales como ratas H-1PV y MVM, son pequeñas, simples virus icosaédricas transición a la competencia, el ADN. Su genoma incluye dos promotores P4 y P38 que regulan la expresión de proteínas no estructurales (NS1 y NS2) y cápside (VP1 y VP2), respectivamente 1. Ellos atraen el interés de alta como agentes contra el cáncer para sus habilidades y oncolíticos oncosuppressive al tiempo que no patógeno para los seres humanos 2. NS1 es el efector principal de 3 citotoxicidad viral. Con el fin de mejorar aún más sus actividades antineoplásicos naturales, derivados de estos vectores se han generado mediante la sustitución del gen que codifica para las proteínas de la cápside con un transgén terapéutico (por ejemplo, un polipéptido citotóxico, citoquinas, quimioquinas, gen supresor tumoral, etc) 4. Los parvovirus recombinantes (recPVs) vector retiene las secuencias NS1 / 2 de codificación y los telómeros genoma fotovoltaicos que son necesarias para la amplificación del ADN viral y el envasado. Producción derecPVs se produce sólo en las células productoras (generalmente HEK293T), por la co-transfección de las células con un segundo vector (pCMV-VP) que expresan el gen que codifica para las proteínas VP (fig. 1) 4. Los vectores recPV generadas de esta manera son replicación defectuosa. Aunque recPVs demostrado poseer actividades mejoradas oncotoxic con respecto a los virus parentales de los que han sido generadas, su producción sigue siendo un reto importante y fuertemente obstaculiza el uso de estos agentes anti-cáncer en aplicaciones clínicas. Hemos encontrado que la introducción de un vector de Ad-5 que contiene el derivado E2a, E4 (orf6) y los genes VA RNA (por ejemplo pXX6 plásmido) en HEK293T mejoró la producción de recPVs por más de 10 veces en comparación con otros protocolos en uso. Con base en este hallazgo, hemos construido una novela Ad-VP-helper que contiene los elementos genómicos adenovirales necesarias para aumentar la producción de recPVs así como la parvovirnos VP gen la unidad 5. El uso de Ad-VP-ayudante, permite la producción de reco-PV usando un protocolo que se basa enteramente en los pasos infección viral (en oposición a la transfección del plásmido), lo que hace posible el uso de líneas celulares que son difíciles de transfectar (por ejemplo, NB324K) ( fig. 2). Se presenta un método que mejora enormemente la cantidad de virus recombinante producida, reduciendo tanto el tiempo de producción y los costes, sin afectar la calidad del producto final 5. Además, la producción a gran escala de recPV (en células en suspensión y biorreactores) es ahora concebible.

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Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Aquí se describe un protocolo basado solamente en la infección de células, lo que mejora la eficiencia de la producción recombinante de parvovirus por más de 100 veces en comparación con otros protocolos en uso. Este protocolo se basa en el uso de un nuevo adenovirus 5-basado auxiliar que contiene el VP parvovirus unidad de transcripción (Ad-VP).

Producción eficiente de parvovirus recombinante con la ayuda de derivados de adenovirus-Systems

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

Research

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Investigación

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Recombinante de producción retrovirales y la infección de células B

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

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