Name: efficient recombinant parvovirus production with the help of adenovirus-derived systems
Uploaded: 2012-04-23T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems at JoVE.com

Vi tackar personalen för den DKFZ virusproduktion och utvecklingsenhet, i synnerhet Marcus Müller, Silvia Münstermann, Barbara Liebetrau och Mandy Roscher. Denna studie har delvis finansierats med bidrag från det federala ministeriet för utbildning och forskning (BMBF) och Helmholtz Association inom ramen för Deutsches Krebsforschungszentrum / Cancéropôle du Grand-Est gemensamma programmet Applied tumör Virology.

Notera att ett laboratorium med en skyddsnivå 2 erfordras för produktion av rekombinanta parvovirus (recPV). Protokollet är uppdelad i två huvuddelar. Den första delen (framställning av recPV via transfektion) krävs för att producera den minimala mängden av recPVs som fungerar som inokulum i den andra delen av det protokoll (framställning av recPVs via infektion). När en liten mängd av recPVs produceras, den första delen av det protokoll som kan utelämnas, och den rekombinanta ...

<ol>
	<li>Cotmore, S. F., Tattersall, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parvoviral+host+range+and+cell+entry+mechanisms.">Parvoviral host range and cell entry mechanisms.</a> Adv. Virus. Res. 70, 183 (2007).</li><li>Rommelaere, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+parvoviruses+as+cancer+therapeutics.">Oncolytic parvoviruses as cancer therapeutics.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 21, 185 (2010).</li><li>Hristov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Through+Its+Nonstructural+Protein+NS1,+Parvovirus+H-1+Induces+Apoptosis+via+Accumulation+of+Reactive+Oxygen+Species.">Through Its Nonstructural Protein NS1, Parvovirus H-1 Induces Apoptosis via Accumulation of Reactive Oxygen Species.</a> J. Virol. 84, 5909-5909 (2010).</li><li>Cornelis, J. J., Salome, N., Dinsart, C., Rommelaere, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vectors+based+on+autonomous+parvoviruses:+novel+tools+to+treat+cancer.">Vectors based on autonomous parvoviruses: novel tools to treat cancer.</a> J. Virol. 6, 193-193 (2004).</li><li>El-Andaloussi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+adenovirus-based+helper+system+to+support+production+of+recombinant+parvovirus.">Novel adenovirus-based helper system to support production of recombinant parvovirus.</a> Cancer Gene Ther. 18, (2011).</li><li>Kestler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cis+requirements+for+the+efficient+production+of+recombinant+DNA+vectors+based+on+autonomous+parvoviruses.">cis requirements for the efficient production of recombinant DNA vectors based on autonomous parvoviruses.</a> Hum. Gene. Ther. 10, 1619-1619 (1999).</li><li>Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+high-titer+recombinant+adeno-associated+virus+vectors+in+the+absence+of+helper+adenovirus.">Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus.</a> J. Virol. 72, 2224 (1998).</li><li>He, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+system+for+generating+recombinant+adenoviruses.">A simplified system for generating recombinant adenoviruses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 2509 (1998).</li><li>Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+adeno-associated+virus+purification+using+novel+methods+improves+infectious+titer+and+yield.">Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield.</a> Gene. Ther. 6, 973 (1999).</li><li>Maxwell, F., Harrison, G. S., Maxwell, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+production+of+recombinant+AAV+by+transient+transfection+of+NB324K+cells+using+electroporation.">Improved production of recombinant AAV by transient transfection of NB324K cells using electroporation.</a> J. Virol. Methods. 63, 129 (1997).</li><li>Wrzesinski, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+and+pseudotyped+parvoviruses+minimize+the+contamination+of+recombinant+stocks+with+replication-competent+viruses+and+identify+a+DNA+sequence+that+restricts+parvovirus+H-1+in+mouse+cells.">Chimeric and pseudotyped parvoviruses minimize the contamination of recombinant stocks with replication-competent viruses and identify a DNA sequence that restricts parvovirus H-1 in mouse cells.</a> J. Virol. 77, 3851 (2003).</li></ol>

Vi har visat att recPV produktion kan förbättras genom närvaron av adenovirala genomiska element. Vi har ökat recPV avkastning med mer än 10 gånger (från 0,3 till 5 TU / cell) genom att tillhandahålla elementet adenovirus genomisk via transfektion och mer än 100 gånger co-infektera cellerna med Ad-VP-helper i kombination med recPV i jämförelse med konventionella protokoll. Protokollet som beskrivs här kan optimeras ytterligare genom att bestämma den lämpligaste tidpunkten för leverans av elementen adenov...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet på reagens </td><td> Företaget </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma </td><td> D5796 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Sigma </td><td> M4655 </td></tr><tr><td> Fetalt bovint serum </td><td> PAA </td><td> A15-101 </td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> Gibco </td><td> 25030-024 </td></tr><tr><td> Fugene </td><td> Roche </td><td> 047097050001 </td></tr><tr><td> Trypsin-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25300062 </td></tr><tr><td> Benzonase Nukleas </td><td> Sigma </td><td> E8263 </td></tr><tr><td> Adeno-X Rapid titer Kit </td><td> Clontech </td><td> 632.250 </td></tr></tbody></table>

efficient recombinant parvovirus production with the help of adenovirus-derived systems

Gnagare parvovirus (PV) såsom råtta H-1PV och MVM, är små ikosaedriska och enkelsträngade, DNA virus. Deras genom består av två promotorer P4 och P38, vilka reglerar expression av icke-strukturella (NS1 och NS2) och kapsid-proteiner (VP1 och VP2) respektive 1. De drar stort intresse som anticancermedel för sina onkolytiska och oncosuppressive förmågor samtidigt som icke-patogena för människor 2. NS1 är den största effektorn av viral cytotoxicitet 3. För att ytterligare förbättra deras naturliga antineoplastiska aktiviteter har derivat från dessa vektorer har genererats genom att ersätta genen som kodar för kapsidproteinerna med en terapeutisk transgen (t.ex. en cytotoxisk polypeptid, cytokin, kemokin, tumörsuppressorgen etc) 4. De rekombinanta parvovirus (recPVs) vektor bibehåller NS1 / 2 kodande sekvenser och de PV telomererna genomet som är nödvändiga för viral DNA-amplifiering och förpackning. Produktion avrecPVs uppträder endast i de producerande cellerna (vanligtvis HEK293T), genom att samtransfektera cellerna med en andra vektor (pCMV-VP) som uttrycker genen som kodar för VP-proteinerna (Fig. 1) 4. De recPV vektorerna som genereras på detta sätt är replikationsdefekt. Även recPVs visat sig ha förhöjda oncotoxic aktiviteter med avseende på föräldrarnas virus från vilken de har genererats fortfarande sin produktion en stor utmaning och starkt hämmar användningen av dessa medel i anti-cancer kliniska tillämpningar. Vi fann att införandet av en AD-5 härledda vektorn innehållande E2a, E4 (ORF6) och VA-RNA-gener (t.ex. pXX6 plasmid) i HEK293T förbättrade produktionen av recPVs med mer än 10 gånger i jämförelse med andra protokoll som används. Baserat på denna upptäckt har vi konstruerat en ny Ad-VP-helper som innehåller de genomiska adenovirala element som är nödvändiga för att öka recPVs produktionen samt parvoviross VP genenhet 5. Användningen av Ad-VP-helper, möjliggör produktion av rec-PV med ett protokoll som bygger helt på virala infektioner steg (i motsats till plasmid transfektion), vilket möjliggör användning av cellinjer som är svåra att transfektera (t.ex. NB324K) ( FIG. 2). Vi presenterar en metod som i hög grad förbättrar den mängd rekombinant virus som produceras, vilket minskar både produktionstid och kostnader, utan att påverka kvaliteten hos den slutliga produkten 5. Dessutom är storskalig produktion av recPV (i suspensionsceller och bioreaktorer) nu tänkbara.

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems at JoVE.com

Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Här beskriver vi ett protokoll baseras endast på cell-infektion, vilket förbättrar effektiviteten av rekombinant parvovirus produktionen med mer än 100 gånger i jämförelse med andra protokoll som används. Detta protokoll bygger på användningen av en ny adenovirus 5-baserade hjälpar innehållande de parvovirus-enheten VP transkription (Ad-VP).

Effektiv Rekombinant Parvovirus produktion med hjälp av adenovirus-härledda Systems

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Estimating Virus Production Rates in Aquatic Systems

Uppskatta priser Virus Produktion i akvatiska system

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative ...

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

Rekombinant retroviral Produktion och infektion av B-celler

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Optimerade protokoll för effektiv Transfektion av dendritiska celler utan cellmognaden

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Produktion och Titering av rekombinanta Adeno-associerad virala vektorer

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Generering av Rekombinant arenavirus för Vaccine utveckling i FDA-godkända Vero celler

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

Skalbar hög genomströmning Urval Från faguppvisade Syntetiska Antibody bibliotek

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Enkel och effektiv produktion och rening av mus Myelin Oligodendrocyte Glykoprotein för experimentell autoimmun encefalomyelit Studies

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analys av Lymphocyte Extravasation Med användning av ett<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av det mänskliga blod-hjärnbarriären

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

Upptäckt och borttagning Nuclease kontamination vid rening av rekombinant prototyp skummande Virus integras

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Generera rekombinant aviär Herpesvirus vektorer med CRISPR/Cas9 gen redigering

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian ...