Name: measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles
Uploaded: 2012-01-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles at JoVE.com

Yazarlar, yararlı tartışmalar için Eleanor Fleming ve Jessica Chen teşekkür etmek istiyorum. Finansman Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü (NIH-NIAID) Ödülü R15AI079685 ve Araştırma Kurumu Cottrell Koleji Bilim Ödülü verildi. Howard Hughes Tıp Enstitüsü ve Staley fon Ek öğrenci destek sağlanmıştır.

1. Büyük Unilamellar lipid veziküller (luvs) hazırlanması <ol><li> Hücre zarı, 19 tahlil için taklit olarak hizmet vermeye luvs hazırlayın . </li><li> Mix fosfatidilkolin (POPC 760,10 g / mol), phosphatidylglycerol (POPG. 770,99 g / mol), 5-dimethylaminonaphthalene-1-Sülfonil 50 kloroform çözünmüş phosphatidylethanolamine (DNS-PAPA, 994,350 g / mol) (Avanti Polar lipidler) : 45:5 oranı. , Her test deney ve kontrol luvs ayrı bir hazırlık gerektirir gibi iki lipit kek şişeleri hazırlanm...

<ol>
	<li>Henriques, S. T., Melo, M. N., Castanho, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptides+and+antimicrobial+peptides:+how+different+are+they?.">Cell-penetrating peptides and antimicrobial peptides: how different are they?.</a> Biochem. J. 399 (1), 1-1 (2006).</li><li>Trehin, R., Merkle, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chances+and+pitfalls+of+cell+penetrating+peptides+for+cellular+drug+delivery.">Chances and pitfalls of cell penetrating peptides for cellular drug delivery.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 58 (2), 209-209 (2004).</li><li>Temsamani, J., Vidal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+cell-penetrating+peptides+for+drug+delivery.">The use of cell-penetrating peptides for drug delivery.</a> Drug Discov. Today. 9 (23), 1012-1012 (2004).</li><li>Hale, J. D., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+mechanisms+of+action+of+cationic+antimicrobial+peptides+on+bacteria.">Alternative mechanisms of action of cationic antimicrobial peptides on bacteria.</a> Expert Review of Anti-Infective Therapy. 5 (6), 951-951 (2007).</li><li>Nicolas, P., Rosenstein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+host+defense+peptides.">Multifunctional host defense peptides.</a> FEBS J. 276 (22), 6464-6464 (2009).</li><li>Boman, H. G., Agerberth, B., Boman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Action+on+Escherichia-Coli+of+Cecropin-P1+and+Pr-39,+2+Antibacterial+Peptides+from+Pig+Intestine.">Mechanisms of Action on Escherichia-Coli of Cecropin-P1 and Pr-39, 2 Antibacterial Peptides from Pig Intestine.</a> Infection and Immunity. 61 (7), 2978-2978 (1993).</li><li>Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+action+of+the+antimicrobial+peptide+buforin+II:+Buforin+II+kills+microorganisms+by+penetrating+the+cell+membrane+and+inhibiting+cellular+functions.">Mechanism of action of the antimicrobial peptide buforin II: Buforin II kills microorganisms by penetrating the cell membrane and inhibiting cellular functions.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 244 (1), 253-253 (1998).</li><li>Bobone, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thin+line+between+cell-penetrating+and+antimicrobial+peptides:+the+case+of+Pep-1+and+Pep-1-K.">The thin line between cell-penetrating and antimicrobial peptides: the case of Pep-1 and Pep-1-K.</a> J. Pept. Sci. 17 (5), 335-335 (2011).</li><li>Marks, J. R., Placone, J., Hristova, K., Wimley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+Membrane-Translocating+Peptides+by+Orthogonal+High-throughput+Screening.">Spontaneous Membrane-Translocating Peptides by Orthogonal High-throughput Screening.</a> J. Am. Chem. Soc.. , (2011).</li><li>Rosenbluh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+histone+proteins+across+lipid+bilayers+and+Mycoplasma+membranes.">Translocation of histone proteins across lipid bilayers and Mycoplasma membranes.</a> J. Mol. Biol. 345 (2), 387-387 (2005).</li><li>Bárány-Wallje, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+reassessment+of+penetratin+translocation+across+lipid+membranes.">A critical reassessment of penetratin translocation across lipid membranes.</a> Biophys. J. 89 (4), 2513-2513 (2005).</li><li>Henriques, S. T., Costa, J., Castanho, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+beta-galactosidase+mediated+by+the+cell-penetrating+peptide+pep-1+into+lipid+vesicles+and+human+HeLa+cells+is+driven+by+membrane+electrostatic+potential.">Translocation of beta-galactosidase mediated by the cell-penetrating peptide pep-1 into lipid vesicles and human HeLa cells is driven by membrane electrostatic potential.</a> Biochemistry. 44 (30), 10189-10189 (2005).</li><li>Orioni, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+perturbation+by+the+antimicrobial+peptide+PMAP-23:+a+fluorescence+and+molecular+dynamics+study.">Membrane perturbation by the antimicrobial peptide PMAP-23: a fluorescence and molecular dynamics study.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1788 (7), 1523-1523 (2009).</li><li>Ladokhin, A. S., Jayasinghe, S., White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+measure+and+analyze+tryptophan+fluorescence+in+membranes+properly,+and+why+bother?.">How to measure and analyze tryptophan fluorescence in membranes properly, and why bother?.</a> Anal. Biochem. 285 (2), 235-235 (2000).</li><li>Epand, R. M., Epand, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+as+models+for+antimicrobial+peptides.">Liposomes as models for antimicrobial peptides.</a> Methods Enzymol. 372, 124-124 (2003).</li><li>Kobayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+the+novel+antimicrobial+peptide+buforin+2+with+lipid+bilayers:+Proline+as+a+translocation+promoting+factor.">Interactions of the novel antimicrobial peptide buforin 2 with lipid bilayers: Proline as a translocation promoting factor.</a> Biochemistry. 39 (29), 8648-8648 (2000).</li><li>Matsuzaki, K., Murase, O., Fujii, N., Miyajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+a+channel-forming+antimicrobial+peptide,+magainin+2,+across+lipid+bilayers+by+forming+a+pore.">Translocation of a channel-forming antimicrobial peptide, magainin 2, across lipid bilayers by forming a pore.</a> Biochemistry. 34 (19), 6521-6521 (1995).</li><li>Henriques, S. T., Costa, J., Castanho, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluating+the+role+of+strongly+charged+sequences+in+amphipathic+cell-penetrating+peptides:+a+fluorescence+study+using+Pep-1.">Re-evaluating the role of strongly charged sequences in amphipathic cell-penetrating peptides: a fluorescence study using Pep-1.</a> FEBS Lett. 579 (20), 4498-4498 (2005).</li><li>Torchilin, V. P., Weissig, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Liposomes. , (2003).</li><li>Almeida, P. F., Pokorny, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avanti+Polar+Lipids,+Determination+of+Total+Phosphorus.">Avanti Polar Lipids, Determination of Total Phosphorus.</a> Biochemistry. 1686 (34), 8083-8083 (2009).</li><li>Kobayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+translocation+mechanism+of+the+antimicrobial+peptide+buforin+2.">Membrane translocation mechanism of the antimicrobial peptide buforin 2.</a> Biochemistry. 43 (49), 15610-15610 (2004).</li></ol>

Burada sunulan protokol lipid veziküllerin içinde ve dışında peptidler konsantrasyon göreceli değişimi değerlendirmek için kullanılabilir. Bu değişiklikler translokasyon yeteneği ile ilgilidir. Bu protokol, ilaç taşıyıcı vektörler olarak potansiyeli olan hücre delici peptidler tanımlamak için kullanılabilir. Hücre delici peptidler ilgi büyüdükçe, nicel bir şekilde, doğrudan translokasyon olayı ölçme yöntemleri geliştirilmiş ve nasıl kullanıldığını görmek için ilginç olacak. ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> 16:00-18:01 PG </td><td> Avanti Polar lipidler </td><td> 840457C </td></tr><tr><td> 01:18 Dansyl PE </td><td> Avanti Polar lipidler </td><td> 810330C </td></tr><tr><td> 16:00-18:01 PC </td><td> Avanti Polar lipidler </td><td> 850457C </td></tr><tr><td> Domuz tripsin </td><td> Sigma </td><td> T-0303 </td></tr><tr><td> Bowman-Birk tripsin / kimotripsin inhibitörü </td><td> Sigma </td><td> T-9777 </td></tr><tr><td> Mini-extruder </td><td> Avanti Polar lipidler </td><td> 610000 </td></tr><tr><td> Amonyum molibdat (para) </td><td> Alfa Aesar </td><td> 10811 </td></tr><tr><td> L-askorbik asit </td><td> Sigma </td><td> A1417 </td></tr><tr><td> Hidrojen Peroksit,% 30 çözüm </td><td> Mallinckrodt kimyasalları </td><td> 5240-05 </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Sigma </td><td> H-3375 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S-9625 &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E5134 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma </td><td> S-0751 </td></tr></tbody></table>

measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles

Hücre zarları, hücre membran reseptörleri 1 yardımı olmadan kolayca çapraz peptidler aktif bir ilgi vardır . Bunların çoğu, sık sık ilaç taşıyıcı vektörler 1-3 olarak potansiyeli ile dikkat çeken hücre delici peptidler, olarak adlandırılır. Ayrıca, özellikle 4,5 membran litik olmayan mekanizmaları, hücre parçalama neden olmadan bakteri membranlar arası ve hücre içi süreçleri ile 6,7 müdahale ederek hücrelerini öldürmek ile faaliyet antimikrobiyal peptidler artan bir ilgi var . Nitekim, yazarlar, giderek hücre delici ve antimikrobiyal peptidler 1,8 arasındaki ilişkiyi işaret var . Membranı translokasyonu ve peptid yapısı ve yerini değiştirmek yeteneği arasında ilişki sürecinde bir firma anlayışı translokasyon için etkili, tekrarlanabilir testleri gerektirir. Bazı gruplar büyük unilamel içine translokasyon ölçmek için yöntemler önerdilar lipid veziküller (luvs) 9-13. Luvs bakteriyel ve ökaryotik hücre zarları için faydalı model olarak hizmet veren ve peptid floresan çalışmaları 14,15 sık sık kullanılır . Burada, ilk magainin ve buforin II 16,17 gibi antimikrobiyal peptidler, dikkate Matsuzaki ve arkadaşları tarafından geliştirilen yöntemin bizim uygulama açıklar. Bu yöntem için protokol sağlamaya ek olarak, biz de bu testte kullanarak translokasyon yeteneği rakamlarla veri analizi için basit bir yaklaşım sunuyoruz. Bu translokasyon testin diğerlerine göre avantajları membranı translokasyonu oranı hakkında bilgi vermek ve triptofan içeren peptidler, peptid özellikleri 18 değiştirebilir Ayrıca, floresan bir etiket gerektirmez bir potansiyele sahip olduğunu. Kısaca, lipid veziküller içine translokasyon yeteneği yerli triptofan artıkları ve d arasında Foster Rezonans Enerji Transferi (FRET) bir fonksiyonu olarak ölçülüransyl phosphatidylethanolamine proteinler ile ilişkili dış membran (Şekil 1) LUV. Hücre-delici peptidler luvs kapsüllenir sınır tanımayan tripsin karşılaşırsanız LUV membran ve sinyal FRET bir düşüş disassociation yol açan, bölünmüş. Translocating peptid için bu düşüş gözlenen sinyal luvs tripsin ve tripsin inhibitörü ya da lipid membranlar kendiliğinden çapraz peptid içeren tripsin luvs için maruz kaldığı hem de içeren aynı peptid gözlenen daha anlamlı olarak daha fazla FRET. Floresans bu değişiklik zamanla peptid translokasyonu doğrudan kantifikasyon sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles at JoVE.com

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

Bu protokol, büyük unilamellar lipid veziküller içine peptid translokasyonu kantitatif ölçmek için bir yöntem. Bu yöntem ayrıca membran translokasyon oranı hakkında bilgi sağlar ve çift katlı lipit katmanını etkin ve kendiliğinden geçtiğini peptidler tanımlamak için kullanılabilir.

Büyük Unilamellar Veziküller Ölçme Peptid Translokasyon

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

Research

JoVE Journal

Biology

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic Kütüphaneler Büyük Ölçekli Ekranlar

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Large Insert Environmental Genomic Library Production

Büyük Ekle Çevre Genomik Kütüphane Üretim

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

İyon Kanalları ve Fonksiyonel Analiz Mutagenez Heterologously Memeli Hücreleri cinsinden ifade edilir

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Akış Sitometri Plazma Membran GLUT4 Translokasyon Kantitatif Ölçüm

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Floresan Proteinleri Polarize Translokasyon Xenopus Wnt Sinyalizasyonu Cevabı Ektoderm

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic ...

Examining BCL-2 Family Function with Large Unilamellar Vesicles

Büyük ünilamellar Veziküller ile incelenmesi BCL-2 Aile Fonksiyonu

The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Bir transmembran proteinin yeniden oluşturulması, Mikroskop ve yama kelepçe Çalışmaları Dev tek-katmanlı keseler içine Voltaj kapılı iyon kanalı, KvAP,

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Peptit bağlanma floresan protein DNA ile yüzey-gergin büyük DNA moleküllerinin Görselleştirme

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

Membran nanotüpler dev Unilamellar veziküller çekerek

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Büyük gözlü manken coğrafi Atrofi, içine insan embriyonik kök hücre elde edilen retina Pigment epitel hücrelerinin subretinal nakli

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...