Name: assessing somatic hypermutation in ramos b cells after overexpression or knockdown of specific genes
Uploaded: 2011-11-01T13:00:00
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Die pMSCV-AID-I-Thy1.1 und pKat2 Vektoren wurden freundlicherweise von DG Schatz und die pVSV-G, pRSV-Rev und pMDLg / pRRE Vektoren wurden freundlicherweise von BR Cullen.

1. Probenvorbereitung und Zellen <ol><li> Führen Sie eine mittlere Vorbereitung von DNA (Midiprep) der Überexpression oder shRNA-haltigen Konstrukte und die retroviralen Vektors Verpackung pKat2 oder lentiviralen Verpackung Vektoren pVSV-G, pMDLg / pRRE und pRSV-Rev 25. Verwenden Sie 6 ug DNA für jedes Konstrukt und entweder 4 pg pKat2 (für retrovirale Infektionen) oder 1,5 ug DNA für jedes der pVSV-g, pMDLg / pRRE und pRSV-Rev Verpackung Vektoren (für lentiviralen Infektionen). </li><li> Bereiten Sie...

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Wie bereits erläutert, haben Zelllinie Modelle für die Antikörper-Diversifizierung zu einem beliebten Ausgangspunkt, um neuartige Proteine, die verschiedene Schritte Einfluss während Antikörper Diversifizierung zu identifizieren. Wir stellen hier ein Verfahren zur Verwendung Virusinfektion entweder knock-down oder überexprimieren Proteine ​​in der Ramos B-Zell-Linie und dann die Auswirkungen auf SHM. Für diese Studien nutzen wir sowohl WT Ramos und AID hallo Ramos-Zelle...

Empfohlene Reagenzien - die meisten von ihnen kann mit ähnlichen Produkten anderer Hersteller ersetzt werden. <table border="1" ><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th > Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td > 6-well klaren TC-behandelten Platten </td><td > Corning </td><td> 3516 </td><td ></td></tr><tr><td > 10 mL BD Luer-Loksyringes </td><td > BD Medical </td><td > 309604 </td><td ></td></tr><tr><td> 24-well klaren TC-behandelten Platten </td><td > Corning </td><td > 3526 </td><td></td></tr><tr><td > 96-well deutlich flacher Boden Polystyrol TC-behandelten Mikrotiterplatten </td><td > Corning </td><td > 3596 </td><td ></td></tr><tr><td > 100 mm TC-behandelten Kulturschalen </td><td > Corning </td><td > 430167 </td><td ></td></tr><tr><td > Acrodisc Spritzenfilter, 0,45 um </td><td > Pall Life Sciences </td><td > 4604 </td><td ></td></tr><tr><td > Agar </td><td > Teknova </td><td > A7777 </td&gt; <td ></td></tr><tr><td > Agarose </td><td > GeneMate </td><td> E-3120-500 </td><td ></td></tr><tr><td > Ampicillin </td><td> Sigma </td><td > A0166 </td><td> 100 mg / mL in Wasser </td></tr><tr><td > BD FACSCanto II Durchflusszytometer </td><td> BD Biosciences </td><td ></td><td > oder ähnliche </td></tr><tr><td> BD Falcon Rundboden Polystyrol-Röhrchen </td><td> BD Biosciences </td><td > 352054 </td><td > für FACS </td></tr><tr><td > BOSC 23-Zellen </td><td > ATCC </td><td > CRL-11270 </td><td ></td></tr><tr><td > CO 2-Inkubator in der Lage 37 ° C </td><td ></td><td ></td><td ></td></tr><tr><td > DMEM (Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium) </td><td > Sigma </td><td> D6429 </td><td ></td></tr><tr><td > FBS (fötales Rinderserum) </td><td > Gemini-Bio-Produkte </td><td > 100-106 </td><td ></td></tr><tr><td > FITC α-Ratte CD90/mouse CD90.1 Antikörper </td><td > BioLegend </td><td > 202503 </td><td > FITCα-Thy1.1 </td></tr><tr><td > FuGENE 6 Transfektionsreagenz </td><td > Roche </td><td > 11814443001 </td><td></td></tr><tr><td > HEPES-Pufferlösung </td><td > Invitrogen </td><td > 15630-080 </td><td ></td></tr><tr><td > KAPA HiFi-DNA-Polymerase </td><td > KAPA Biosystems </td><td > KK2101 </td><td ></td></tr><tr><td > LB Broth (Lysogenie Brühe - Luria) Pulver </td><td > Difco </td><td > 240230 </td><td ></td></tr><tr><td > MISSION TRC shRNA bakterielle Glycerin Lager </td><td > Sigma </td><td ></td><td> shRNA-Vektoren </td></tr><tr><td > NCS (Neugeborenen Kälberserum) </td><td > Gemini-Bio-Produkte </td><td > 100-504 </td><td ></td></tr><tr><td> PBS (Phosphat-gepufferte Lösung) </td><td > Invitrogen </td><td> 70011 </td><td > verdünnt auf 1x im Wasser </td></tr><tr><td > PE α-human-IgM-Antikörper </td><td > BioLegend </td><td > 314508 </td><td ></td></tr><tr><td > PGS (Penicillin-Streptomycin-Glutamin-Lösung) </td><td > Gemini-Bio-Produkte </td><td > 400-110 </td><td ></td></tr><tr><td> Polybrene (Hexadimethrinbromid) </td><td > Sigma </td><td > 107689 </td><td > 10 mg / mL in Wasser </td></tr><tr><td > PureYield Plasmid Midiprep-System </td><td > Promega </td><td > A2495 </td><td></td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> Sigma </td><td > P8833 </td><td > 250 ug / mL in Wasser </td></tr><tr><td > QIAquick Gel Extraction Kit </td><td > QIAGEN </td><td > 28706 </td><td ></td></tr><tr><td> Ramos (RA 1) Zellen </td><td > ATCC </td><td > CRL-1596 </td><td ></td></tr><tr><td > RPMI-1640 Medium </td><td > Sigma </td><td > R8758 </td><td ></td></tr><tr><td > SuperScript II </td><td > Invitrogen </td><td > 18064-022 </td><td></td></tr><tr><td > SYBR FAST qPCR Kit </td><td > KAPA Biosystems </td><td > KK4601 </td><td ></td></tr><tr><td > Taq DNA Polymerase </td><td > Invitrogen </td><td > 18038-042 </td><td ></td></tr><tr><td > TOPO TA Cloning Kit </td><td > Invitrogen </td><td > K4520-01 </td><td ></td></tr><tr><td > TRIzol </td><td > Invitrogen </td><td > 15596-026 </td><td ></td></tr><tr><td > Wizard SV Genomic DNA Reinigungssystem </td><td > Promega </td><td > A2361 </td><td ></td></tr><tr><td > X-Gal [5-Brom-4-Chlor-3-indoyl-β-D-galatopyranoside] </td><td > Growcells </td><td > C-5687 </td><td > 40 mg / mL in DMSO </td></tr></tbody></table>

assessing somatic hypermutation in ramos b cells after overexpression or knockdown of specific genes

B-Zellen beginnen ihr Leben mit niedriger Affinität Antikörper durch V (D) J-Rekombination erzeugt. Doch beim Erkennen eines Krankheitserregers, wird die Variable (V) Region eines Immunglobulins (Ig)-Gen etwa 100.000-fach stärker als der Rest des Genoms durch somatische Hypermutation (SHM), mutiert wodurch Antikörper mit hoher Affinität 1,2. Darüber hinaus produziert der Klasse Switch-Rekombination (CSR)-Antikörper mit verschiedenen Effektor-Funktionen, je nach Art der Immunantwort, die für einen bestimmten Erreger benötigt wird. Beide CSR und SHM durch activation-induced Cytidindeaminase (AID), die Cytosin-Reste in DNA um Uracile produzieren desaminiert eingeleitet. Diese Uracile sind fehleranfällig Formen der Reparaturwege verarbeitet, was schließlich zu Mutationen und Rekombination 1-3. Unser gegenwärtiges Verständnis der molekularen Details der SHM und CSR komme aus einer Kombination von Studien an Mäusen, primäre Zellen, Zelllinien und Zell-free Experimente. Mausmodelle bleiben den Goldstandard mit genetischen Knockouts zeigt eine entscheidende Rolle für viele Reparatur-Faktoren (zB Ung, MSH2, MSH6 Exo1 und Polymerase η) 4-10. Allerdings sind nicht alle Gene zugänglich für Knockout-Studien. Zum Beispiel sind Knockouts von mehreren Doppelstrangbruch Reparatur-Proteine ​​embryonal letalen oder beeinträchtigen B-Zell-Entwicklung 11-14. Darüber hinaus manchmal die spezifische Funktion eines Proteins in SHM-oder CSR kann durch weitere globale Defekte, die durch die Ko verursacht maskiert werden. Darüber hinaus können seit Experimente in Mäusen als langwierig, zu verändern Expression einzelner Gene in Zelllinien ist ein zunehmend beliebtes erste Schritt zur Identifizierung und Charakterisierung Kandidatengene 15-18. Ramos - ein Burkitt-Lymphom-Zelllinie, die konstitutiv erfährt SHM - ein beliebtes Zell-Linie Modell SHM 18-24 Studie. Ein Vorteil der Ramos-Zellen ist, dass sie einen eingebauten günstigen, halb haben-Quantitatives Maß für SHM. Wildtyp-Zellen exprimieren IgM und, wie sie abholen Mutationen, einige der Mutationen knock out IgM Ausdruck. Deshalb Testen IgM Verlust durch Fluoreszenz-activated cell Scanning (FACS) bietet einen schnellen Auslesen für die Höhe der SHM. Eine quantitative Messung der SHM kann durch direkte Sequenzierung der Antikörper-Gene erreicht werden. Seit Ramos-Zellen schwer zu transfizieren sind, produzieren wir stabile Derivate, die erhöht oder gesenkt haben Ausdruck eines einzelnen Gens durch Infektion der Zellen mit retroviralen oder lentiviralen Konstrukte, die entweder eine Überexpression Kassette oder eine kurze Haarnadel-RNA (shRNA), jeweils enthalten. Hier beschreiben wir, wie wir Ramos Zellen zu infizieren und dann diese Zellen die Rolle bestimmter Gene auf SHM (Abbildung 1) zu untersuchen.

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Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

Wir beschreiben, wie retroviralen oder lentiviralen Infektionen der Überexpression oder shRNA-Konstrukte, die in das menschliche Ramos B-Zell-Linie und wie somatische Hypermutation in diesen Zellen zu messen. Durchführen

Die Beurteilung Somatische Hypermutation in Ramos B-Zellen nach Überexpression oder Knockdown von spezifischen Genen

B cells start their life with low affinity antibodies generated by V(D)J recombination.  However, upon detecting a pathogen, the variable (V) region of an ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

Mausmodell der CD40-Aktivierung von B-Zellen

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

Induktion und Beurteilung der Class Schalter Rekombination in Purified Murine B-Zellen

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Generierung von Multivirus-spezifischen T-Zellen zu verhindern / zu behandeln virale Infektionen nach allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Nach Cell-Schicksal<em&gt; E. coli</em&gt; Nach Infektion mit Phagen

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

Der Nachweis von IgE-Wahre exprimierenden Maus B Lineage Cells

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Detektion und Anreicherung von Rare Antigen-spezifische B-Zellen für die Analyse von Phänotypen und Funktion

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Generation von diskriminierendem menschlichen monoklonalen Antikörpern aus seltenen Antigen-spezifische B-Zellen im Blut zirkulierenden

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding

Bewertung von zellulären Stresses und Entzündung im diskreten Oxytocin-sezernierenden Gehirn Kerne bei Neugeborenen Ratten vor und nach der ersten Fütterung Kolostrum

The goal of this protocol is to isolate oxytocin-receptor rich brain nuclei in the neonatal brain before and after first colostrum feeding. The expression ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Analyse der Scherung strömungsinduzierte Migration der Murine Marginal Zone B-Zellen In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation

Studium der Organelle-Dynamik in B-Zellen während der Immunsynapse-Bildung

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both ...