Name: assessing somatic hypermutation in ramos b cells after overexpression or knockdown of specific genes
Uploaded: 2011-11-01T13:00:00
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pMSCV - AID - I - Thy1.1とpKat2ベクトルはDGシャッツから親切な贈り物だったとpVSV - G、pRSV - REV、およびpMDLg / pRREベクトルはBRカレンから親切な贈り物でした。

1。準備サンプルと細胞<ol><li>過剰発現のDNAの中規模の準備（ミディプレップ）またはshRNAを含むコンストラクトとレトロウイルスパッケージングベクトルpKat2またはレンチウイルスのパッケージングベクターをpVSV - G、pMDLg / pRRE、およびpRSV -リビジョン25を実行します。各構築物とpKat24μgの（レトロウイルス感染症の場合）またはpVSV - G、pMDLg / pRRE、およびpRSV - REVのパッケージングベ...

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	<li>Di Noia, J. M., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+antibody+somatic+hypermutation.">Molecular mechanisms of antibody somatic hypermutation.</a> Annu. Rev. Biochem. 76, 1-22 (2007).</li><li>Peled, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biochemistry+of+somatic+hypermutation.">The biochemistry of somatic hypermutation.</a> Annu. Rev. Immunol. 26, 481-511 (2008).</li><li>Longerich, S., Basu, U., Alt, F., Storb, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AID+in+somatic+hypermutation+and+class+switch+recombination.">AID in somatic hypermutation and class switch recombination.</a> Curr. Opin. 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S., Hasty, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutation+in+mouse+rad51+results+in+an+early+embryonic+lethal+that+is+suppressed+by+a+mutation+in+p53.">A mutation in mouse rad51 results in an early embryonic lethal that is suppressed by a mutation in p53.</a> Mol. Cell. Biol. 16, 7133-7143 (1996).</li><li>Xiao, Y., Weaver, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+gene+targeted+deletion+by+Cre+recombinase+demonstrates+the+requirement+for+the+double-strand+break+repair+Mre11+protein+in+murine+embryonic+stem+cells.">Conditional gene targeted deletion by Cre recombinase demonstrates the requirement for the double-strand break repair Mre11 protein in murine embryonic stem cells.</a> Nucleic. Acids. Res. 25, 2985-2991 (1997).</li><li>Zhu, J., Petersen, S., Tessarollo, L., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+disruption+of+the+Nijmegen+breakage+syndrome+gene+NBS1+leads+to+early+embryonic+lethality+in+mice.">Targeted disruption of the Nijmegen breakage syndrome gene NBS1 leads to early embryonic lethality in mice.</a> Curr. Biol. 11, 105-109 (2001).</li><li>Luo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+mRad50+causes+embryonic+stem+cell+lethality,+abnormal+embryonic+development,+and+sensitivity+to+ionizing+radiation.">Disruption of mRad50 causes embryonic stem cell lethality, abnormal embryonic development, and sensitivity to ionizing radiation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7376-7381 (1999).</li><li>Pavri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation-induced+cytidine+deaminase+targets+DNA+at+sites+of+RNA+polymerase+II+stalling+by+interaction+with+Spt5.">Activation-induced cytidine deaminase targets DNA at sites of RNA polymerase II stalling by interaction with Spt5.</a> Cell. 143, 122-133 (2010).</li><li>Lee-Theilen, M., Matthews, A. J., Kelly, D., Zheng, S., Chaudhuri, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CtIP+promotes+microhomology-mediated+alternative+end+joining+during+class-switch+recombination.">CtIP promotes microhomology-mediated alternative end joining during class-switch recombination.</a> Nat. Struct. Mol. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TdT-accessible+breaks+are+scattered+over+the+immunoglobulin+V+domain+in+a+constitutively+hypermutating+B+cell+line.">TdT-accessible breaks are scattered over the immunoglobulin V domain in a constitutively hypermutating B cell line.</a> Immunity. 9, 859-869 (1998).</li><li>Cumbers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+iterative+affinity+maturation+of+antibodies+in+vitro+using+hypermutating+B-cell+lines.">Generation and iterative affinity maturation of antibodies in vitro using hypermutating B-cell lines.</a> Nat. Biotechnol. 20, 1129-1134 (2002).</li><li>Papavasiliou, F. N., Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cycle-regulated+DNA+double-stranded+breaks+in+somatic+hypermutation+of+immunoglobulin+genes.">Cell-cycle-regulated DNA double-stranded breaks in somatic hypermutation of immunoglobulin genes.</a> Nature. 408, 216-221 (2000).</li><li>Parsa, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AID+mutates+a+non-immunoglobulin+transgene+independent+of+chromosomal+position.">AID mutates a non-immunoglobulin transgene independent of chromosomal position.</a> Mol. Immunol. 44, 567-575 (2007).</li><li>Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+instability+of+V+region+hypermutation+in+the+Ramos+Burkitt's+lymphoma+cell+line.">Clonal instability of V region hypermutation in the Ramos Burkitt's lymphoma cell line.</a> Int. Immunol. 13, 1175-1184 (2001).</li><li>Ukai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a:T+mutations+is+dependent+on+cellular+environment+but+independent+of+mutation+frequency+and+target+gene+location.">Induction of a:T mutations is dependent on cellular environment but independent of mutation frequency and target gene location.</a> J. Immunol. 181, 7835-7842 (2008).</li><li>Dull, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system.">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).</li><li>Nakamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequency+class+switching+of+an+IgM++B+lymphoma+clone+CH12F3+to+IgA++cells.">High frequency class switching of an IgM+ B lymphoma clone CH12F3 to IgA+ cells.</a> Int. Immunol. 8, 193-201 (1996).</li><li>Muramatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+expression+of+activation-induced+cytidine+deaminase+(AID),+a+novel+member+of+the+RNA-editing+deaminase+family+in+germinal+center+B+cells.">Specific expression of activation-induced cytidine deaminase (AID), a novel member of the RNA-editing deaminase family in germinal center B cells.</a> J. Biol. Chem. 274, 18470-18476 (1999).</li></ol>

前述したように、抗体の多様化のための細胞株のモデルは、抗体の多様化中に別のステップに影響を与える新規タンパク質を同定するために人気の出発点となっている。我々はここにラモスB細胞株におけるノックダウンまたは過剰発現するタンパク質のいずれかにウイルス感染を使用するための方法を提示し、SHMの影響を調べる。 これらの研究では、WTラモスとAID ?...

推奨試薬-これらのほとんどは他のベンダーから同様の製品で置換されていてもよい。 <table border="1" ><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th >会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td > 6ウェル明確なTC処理プレート</td><td >コー​​ニング</td><td> 3516 </td><td ></td></tr><tr><td > 10 mLのBDルアーLoksyringes </td><td > BDメディカル</td><td > 309604 </td><td ></td></tr><tr><td> 24ウェル透明なTC処理プレート</td><td >コー​​ニング</td><td > 3526 </td><td></td></tr><tr><td > 96ウェル透明な平底ポリスチレンTC -処理マイクロプレート</td><td >コー​​ニング</td><td > 3596 </td><td ></td></tr><tr><td > 100ミリメートルTC処理培養皿</td><td >コー​​ニング</td><td > 430167 </td><td ></td></tr><tr><td >アクロディスクシリンジフィルター、孔径0.45μm </td><td >ポールライフサイエンス</td><td > 4604 </td><td ></td></tr><tr><td >寒天</td><td > Teknova </td><td > A7777 </tD&gt; <td ></td></tr><tr><td >アガロース</td><td > GeneMate </td><td> E - 3120 - 500 </td><td ></td></tr><tr><td >アンピシリン</td><td>シグマ</td><td > A0166 </td><td>水中では100 mg / mLの</td></tr><tr><td > BD FACSCanto IIフローサイトメーター</td><td> BDバイオサイエンス</td><td ></td><td >または類似の</td></tr><tr><td> BDファルコン丸底のポリスチレンチューブ</td><td> BDバイオサイエンス</td><td > 352054 </td><td > FACS用</td></tr><tr><td > BOSC 23細胞</td><td > ATCC </td><td > CRL - 11270 </td><td ></td></tr><tr><td > 37の可能なCO 2インキュベーター° C </td><td ></td><td ></td><td ></td></tr><tr><td > DMEM（ダルベッコ改変イーグル培地） </td><td >シグマ</td><td> D6429 </td><td ></td></tr><tr><td > FBS（ウシ胎児血清） </td><td >ジェミニバイオ製品</td><td > 100から106 </td><td ></td></tr><tr><td > FITCα-ラットCD90/mouse CD90.1抗体</td><td > BioLegend </td><td > 202503 </td><td > FITCα- Thy1.1 </td></tr><tr><td > FuGENE 6トランスフェクション試薬</td><td >ロッシュ</td><td > 11814443001 </td><td></td></tr><tr><td > HEPES緩衝液</td><td >インビトロジェン</td><td > 15630-080 </td><td ></td></tr><tr><td > KAPAハイファイDNAポリメラーゼ</td><td > KAPAバイオシステムズ</td><td > KK2101 </td><td ></td></tr><tr><td > LB培地（溶原スープ - ルリア）パウダー</td><td >ディフコ</td><td > 240230 </td><td ></td></tr><tr><td > MISSION TRC shRNAの細菌のグリセロールストック</td><td >シグマ</td><td ></td><td> shRNAベクター</td></tr><tr><td > NCS（新生児ウシ血清） </td><td >ジェミニバイオ製品</td><td > 100から504 </td><td ></td></tr><tr><td> PBS（リン酸緩衝液） </td><td >インビトロジェン</td><td> 70011 </td><td >水で1Xに希釈</td></tr><tr><td > PEα-ヒトIgM抗体</td><td > BioLegend </td><td > 314508 </td><td ></td></tr><tr><td > PGS（ペニシリン - ストレプトマイシン - グルタミン溶液） </td><td >ジェミニバイオProducts </td><td > 400から110 </td><td ></td></tr><tr><td>ポリブレン（臭化ヘキサジメトリン） </td><td >シグマ</td><td > 107689 </td><td >水に10 mg / mLの</td></tr><tr><td > PureYieldプラスミドミディプレップシステム</td><td >プロメガ</td><td > A2495 </td><td></td></tr><tr><td>ピューロマイシン</td><td>シグマ</td><td > P8833 </td><td >水の250μg/ mLの</td></tr><tr><td > QIAquickゲル抽出キット</td><td > QIAGEN </td><td > 28706 </td><td ></td></tr><tr><td>ラモス（RA 1）細胞</td><td > ATCC </td><td > CRL - 1596 </td><td ></td></tr><tr><td > RPMI - 1640培地</td><td >シグマ</td><td > R8758 </td><td ></td></tr><tr><td >スーパースクリプトII </td><td >インビトロジェン</td><td > 18064-022 </td><td></td></tr><tr><td > SYBR FAST定量PCRキット</td><td > KAPAバイオシステムズ</td><td > KK4601 </td><td ></td></tr><tr><td > Taq DNAポリメラーゼ</td><td >インビトロジェン</td><td > 18038-042 </td><td ></td></tr><tr><td > TOPO TAクローニングキット</td><td >体外ジェン</td><td > K4520 - 01 </td><td ></td></tr><tr><td > TRIZOL </td><td >インビトロジェン</td><td > 15596-026 </td><td ></td></tr><tr><td >ウィザードSVゲノムDNA精製システム</td><td >プロメガ</td><td > A2361 </td><td ></td></tr><tr><td > X - Galを[5 - ブロモ-4 - クロロ-3 - indoyl -β- D - galatopyranoside] </td><td > Growcells </td><td > C - 5687 </td><td > DMSOに40 mg / mLの</td></tr></tbody></table>

assessing somatic hypermutation in ramos b cells after overexpression or knockdown of specific genes

B細胞は、V（D）J組換えにより生成された低親和性の抗体とその生活を始める。しかし、病原体を検出すると、免疫グロブリン（Ig）遺伝子の可変（V）領域は、高親和性抗体の1,2の結果、約10万倍以上の体細胞超変異（SHM）を通じて、ゲノムの他の部分よりも変異している。さらに、クラススイッチ組み換え（CSR）は、特定の病原体に必要とされる免疫応答の種類に応じて、異なるエフェクター機能を有する抗体を産生する。 CSRとSHMの両方は、ウラシルを生成するためにDNAのシトシン残基をdeaminates活性化誘導型シチジンデアミナーゼ（AID）によって開始されています。これらのウラシルは、最終的には突然変異と1-3組換えにつながる、修復経路のエラーが発生しやすいフォームによって処理されます。 マウスでの研究の組み合わせから来るSHMとCSRの分子の詳細、主要な細胞、細胞株、およびセルの- fの私たちの現在の理解REE実験。マウスモデルは、多くの修復因子（例えば雄、MSH2、MSH6、EXO1、およびポリメラーゼη）4-10のために重要な役割を示す遺伝子ノックアウトとゴールドスタンダードのまま。ただし、すべての遺伝子がノックアウトの研究のために適している。例えば、いくつかの二重鎖切断修復タンパク質のノックアウトはembryonically致死的またはB細胞の開発11-14損なう。また、時々SHMやCSRにおけるタンパク質の特定の機能をノックアウトによって引き起こされる多くの世界的な欠陥によってマスクされることがあります。さらに、マウスでの実験以来、細胞株における個々の遺伝子の発現が候補遺伝子15-18識別し、特徴付けるために、ますます人気の第一歩となっている変更、時間がかかる場合があります。 ラモス-構成的にSHMを受けるバーキットリンパ腫細胞株は- SHM 18-24勉強に人気の細胞ラインのモデルとなっています。ラモス細胞の一つの利点は、内蔵の便利なセミを持っていることです。SHMの定量的尺度。野生型の細胞は、突然変異、IgM抗体の発現をノックアウト変異のいくつかをピックアップとして、IgMを発現しており。したがって、蛍光活性化細胞のスキャン（FACS）によってIgMの損失をアッセイすることSHMのレベルのための読み出し迅速に提供します。 SHMのより定量的な測定は、直接抗体遺伝子をシーケンシングすることによって得ることができる。 ラモス細胞はトランスフェクションが困難なので、我々はそれぞれ過剰発現カセットまたは短鎖ヘアピンRNA（shRNA）、のいずれかを含むレトロウイルスやレンチウイルスのコンストラクトで細胞を感染させることによって増加または個々の遺伝子の発現を低下している安定した誘導体を生成する。ここで、我々はラモスの細胞に感染してから、SHM（図1）上の特定の遺伝子の役割を調べるために、これらの細胞を使用する方法について説明します。

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Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

我々は、過剰発現またはshRNAを含む人間ラモスB細胞株とどのようにこれらの細胞で体細胞高頻度変異を測定するためのコンストラクトのレトロウイルスやレンチウイルス感染症を実行する方法について説明します。

特定の遺伝子の過剰発現やノックダウン後にラモスB細胞に体細胞高頻度変異の評価

B cells start their life with low affinity antibodies generated by V(D)J recombination.  However, upon detecting a pathogen, the variable (V) region of an ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

B細胞のCD40 -活性化のモデルマウス

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

免疫・感染学

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

マウスB細胞を精製における誘導とクラススイッチ組み換えの評価

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

同種造血幹細胞移植後のウイルス感染を予防/治療するMultivirus -特異的T細胞の生成

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

細胞運命を以下に<em&gt; E大腸菌の</emラムダファージによる感染後&gt;

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

真のIgE発現するマウスB系統細胞の検出

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

表現型および機能解析のためのレア抗原特異的B細胞の検出および濃縮

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

まれな抗原特異的 B 細胞血液の循環から弁別に対するモノクローナル抗体の生成

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding

前に、最初の初乳の授乳後細胞ストレスと新生児ラットにおける離散のオキシトシン分泌脳核の炎症を評価します。

The goal of this protocol is to isolate oxytocin-receptor rich brain nuclei in the neonatal brain before and after first colostrum feeding. The expression ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

生体外でマウス縁帯 B 細胞のせん断流動誘起移行の解析

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation

免疫シナプス形成中のB細胞におけるオルガネラダイナミクスの研究

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both ...