Name: assessing somatic hypermutation in ramos b cells after overexpression or knockdown of specific genes
Uploaded: 2011-11-01T13:00:00
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pMSCV - AID - I - Thy1.1과 pKat2 벡터는 DG Schatz와 pVSV - G, pRSV - 레브의 종류 선물했고, pMDLg / pRRE 벡터는 BR 컬른에서 어떤 선물했다.

1. 준비 샘플 및 세포 <ol><li> overexpression 또는 shRNA 함유 구성과 retroviral 벡터 pKat2 포장 또는 포장 lentiviral 벡터 pVSV - G, pMDLg / pRRE 및 pRSV - 레브 25.의 DNA (midiprep)의 중간 규모 준비를 수행 각각의 구성 6 μg의 DNA와 pVSV - G, pMDLg / pRRE 각각에 대해 하나 pKat2 4 μg (retroviral 감염의 경우) 또는 1.5 μg의 DNA와 pRSV - 수익 포장 벡터 (lentiviral 감염)을 사용합니다. </li><li> BOSC 23 미디어를 준비합니다. transfe...

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	<li>Di Noia, J. M., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+antibody+somatic+hypermutation.">Molecular mechanisms of antibody somatic hypermutation.</a> Annu. Rev. Biochem. 76, 1-22 (2007).</li><li>Peled, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biochemistry+of+somatic+hypermutation.">The biochemistry of somatic hypermutation.</a> Annu. Rev. Immunol. 26, 481-511 (2008).</li><li>Longerich, S., Basu, U., Alt, F., Storb, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AID+in+somatic+hypermutation+and+class+switch+recombination.">AID in somatic hypermutation and class switch recombination.</a> Curr. Opin. 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A. 96, 7376-7381 (1999).</li><li>Pavri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation-induced+cytidine+deaminase+targets+DNA+at+sites+of+RNA+polymerase+II+stalling+by+interaction+with+Spt5.">Activation-induced cytidine deaminase targets DNA at sites of RNA polymerase II stalling by interaction with Spt5.</a> Cell. 143, 122-133 (2010).</li><li>Lee-Theilen, M., Matthews, A. J., Kelly, D., Zheng, S., Chaudhuri, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CtIP+promotes+microhomology-mediated+alternative+end+joining+during+class-switch+recombination.">CtIP promotes microhomology-mediated alternative end joining during class-switch recombination.</a> Nat. Struct. Mol. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TdT-accessible+breaks+are+scattered+over+the+immunoglobulin+V+domain+in+a+constitutively+hypermutating+B+cell+line.">TdT-accessible breaks are scattered over the immunoglobulin V domain in a constitutively hypermutating B cell line.</a> Immunity. 9, 859-869 (1998).</li><li>Cumbers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+iterative+affinity+maturation+of+antibodies+in+vitro+using+hypermutating+B-cell+lines.">Generation and iterative affinity maturation of antibodies in vitro using hypermutating B-cell lines.</a> Nat. Biotechnol. 20, 1129-1134 (2002).</li><li>Papavasiliou, F. N., Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cycle-regulated+DNA+double-stranded+breaks+in+somatic+hypermutation+of+immunoglobulin+genes.">Cell-cycle-regulated DNA double-stranded breaks in somatic hypermutation of immunoglobulin genes.</a> Nature. 408, 216-221 (2000).</li><li>Parsa, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AID+mutates+a+non-immunoglobulin+transgene+independent+of+chromosomal+position.">AID mutates a non-immunoglobulin transgene independent of chromosomal position.</a> Mol. Immunol. 44, 567-575 (2007).</li><li>Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+instability+of+V+region+hypermutation+in+the+Ramos+Burkitt's+lymphoma+cell+line.">Clonal instability of V region hypermutation in the Ramos Burkitt's lymphoma cell line.</a> Int. Immunol. 13, 1175-1184 (2001).</li><li>Ukai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a:T+mutations+is+dependent+on+cellular+environment+but+independent+of+mutation+frequency+and+target+gene+location.">Induction of a:T mutations is dependent on cellular environment but independent of mutation frequency and target gene location.</a> J. Immunol. 181, 7835-7842 (2008).</li><li>Dull, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system.">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).</li><li>Nakamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequency+class+switching+of+an+IgM++B+lymphoma+clone+CH12F3+to+IgA++cells.">High frequency class switching of an IgM+ B lymphoma clone CH12F3 to IgA+ cells.</a> Int. Immunol. 8, 193-201 (1996).</li><li>Muramatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+expression+of+activation-induced+cytidine+deaminase+(AID),+a+novel+member+of+the+RNA-editing+deaminase+family+in+germinal+center+B+cells.">Specific expression of activation-induced cytidine deaminase (AID), a novel member of the RNA-editing deaminase family in germinal center B cells.</a> J. Biol. Chem. 274, 18470-18476 (1999).</li></ol>

마찬가지로 이전에 논의, 항체 다양성을위한 세포주 모델 항체 다변화하는 동안 여러 단계에 영향을 소설 단백질을 식별하는 인기있는 출발점이되고 있습니다. 우리는 여기서 라모스 B - 세포 라인에 노크 다운 또는 overexpress 중 단백질로 바이러스 감염을 사용하는 방법을 제시하고 SHM에 미치는 영향을 검사합니다. 이러한 연구에 대한, 우리는 WT 라모스와 AID 안녕 라...

추천 시약 - 이들의 대부분은 다른 업체에서 유사한 제품과 대체 수 있습니다. <table border="1" ><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th > 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td > 6 - 잘 맑은 TC - 대우 접시 </td><td > 코닝 </td><td> 3516 </td><td ></td></tr><tr><td > 10 ML BD Luer - Loksyringes </td><td > BD 의료 </td><td > 309,604 </td><td ></td></tr><tr><td> 24 잘 맑은 TC - 대우 접시 </td><td > 코닝 </td><td > 3526 </td><td></td></tr><tr><td > 96 - 웰 맑은 평면 바닥 폴리스티렌 TC - 대우 microplates </td><td > 코닝 </td><td > 3596 </td><td ></td></tr><tr><td > 100mm TC - 대우 문화 요리 </td><td > 코닝 </td><td > 430,167 </td><td ></td></tr><tr><td > Acrodisc 주사기 필터, 0.45 μm의 </td><td > 막 생명 과학 </td><td > 4604 </td><td ></td></tr><tr><td > 한천 </td><td > Teknova </td><td > A7777 </tD&gt; <td ></td></tr><tr><td > 아가로 오스 </td><td > GeneMate </td><td> E - 3120-500 </td><td ></td></tr><tr><td > 암피실린 </td><td> 시그마 </td><td > A0166 </td><td> 물 100 밀리그램 / ML </td></tr><tr><td > BD FACSCanto II 흐름 cytometer </td><td> BD Biosciences </td><td ></td><td > 또는 유사 </td></tr><tr><td> BD 팔콘 원형 바닥 폴리스티렌 튜브 </td><td> BD Biosciences </td><td > 352,054 </td><td > FACS에 대한 </td></tr><tr><td > BOSC 23 세포 </td><td > ATCC </td><td > CRL - 11270 </td><td ></td></tr><tr><td > 37 수 CO 2 배양기 ° C </td><td ></td><td ></td><td ></td></tr><tr><td > DMEM (Dulbecco의 수정 이글 배지) </td><td > 시그마 </td><td> D6429 </td><td ></td></tr><tr><td > FBS (태아 소 혈청) </td><td > 쌍둥이 바이오 제품 </td><td > 100-106 </td><td ></td></tr><tr><td > FITC α - 쥐 CD90/mouse CD90.1 항체 </td><td > BioLegend </td><td > 202,5​​03 </td><td > FITCα - Thy1.1 </td></tr><tr><td > FuGENE 6 Transfection 시약 </td><td > 호슈 </td><td > 11814443001 </td><td></td></tr><tr><td > HEPES 버퍼 솔루션 </td><td > Invitrogen </td><td > 15630-080 </td><td ></td></tr><tr><td > KAPA 고음질의 DNA 효소 </td><td > KAPA Biosystems </td><td > KK2101 </td><td ></td></tr><tr><td > LB 국물 (국물 lysogeny - Luria) 분말 </td><td > Difco </td><td > 240,230 </td><td ></td></tr><tr><td > 임무 TRC shRNA 세균 글리세롤 주식 </td><td > 시그마 </td><td ></td><td> shRNA 벡터 </td></tr><tr><td > NCS (신생아 송아지 혈청) </td><td > 쌍둥이 바이오 제품 </td><td > 100-504 </td><td ></td></tr><tr><td> PBS (인산염 버퍼 용액) </td><td > Invitrogen </td><td> 70,011 </td><td > 물에 1X로 희석 </td></tr><tr><td > PE α - 인간 IgM 항체 </td><td > BioLegend </td><td > 314,508 </td><td ></td></tr><tr><td > PGS (페니실린 - 스트렙토 마이신 - 글루타민 솔루션) </td><td > 쌍둥이 바이오 Products </td><td > 400-110 </td><td ></td></tr><tr><td> Polybrene (hexadimethrine 브로마이드) </td><td > 시그마 </td><td > 107,689 </td><td > 물 10 밀리그램 / ML </td></tr><tr><td > PureYield 플라스미드 Midiprep 시스템 </td><td > Promega </td><td > A2495 </td><td></td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> 시그마 </td><td > P8833 </td><td > 250 μg / 물 속에 ML </td></tr><tr><td > QIAquick 겔 추출 키트 </td><td > QIAGEN </td><td > 28,706 </td><td ></td></tr><tr><td> 라모스 (RA 1) 세포 </td><td > ATCC </td><td > CRL - 1596 </td><td ></td></tr><tr><td > RPMI - 1640 배지 </td><td > 시그마 </td><td > R8758 </td><td ></td></tr><tr><td > 어깨 II </td><td > Invitrogen </td><td > 18064-022 </td><td></td></tr><tr><td > SYBR FAST qPCR 키트 </td><td > KAPA Biosystems </td><td > KK4601 </td><td ></td></tr><tr><td > DNA 형성 촉매 DNA 중합 효소 </td><td > Invitrogen </td><td > 18038-042 </td><td ></td></tr><tr><td > TOPO TA 복제 키트 </td><td > Invitro세대 </td><td > K4520 - 01 </td><td ></td></tr><tr><td > TRIzol </td><td > Invitrogen </td><td > 15596-026 </td><td ></td></tr><tr><td > 마법사 SV의 게놈 DNA의 정화 시스템 </td><td > Promega </td><td > A2361 </td><td ></td></tr><tr><td > X - 걸 [5 - 브로모 -4 - 클로로 - 3 - indoyl - β - D - galatopyranoside] </td><td > Growcells </td><td > C - 5687 </td><td > DMSO 40 밀리그램 / ML </td></tr></tbody></table>

assessing somatic hypermutation in ramos b cells after overexpression or knockdown of specific genes

B 세포는 V (D) J 재조합에 의해 생성된 낮은 친화 항체와 그들의 인생을 시작합니다. 그러나 병원체를 감지시, 면역 글로불린 (IG) 유전자의 변수 (V) 지역은 높은 친화 항체 1,2의 결과로, 약 100,000 배 더 체세포 hypermutation (SHM)을 통해 게놈의 나머지 부분보다 변이이다. 또한, 클래스 스위치 재조합 (CSR)은 특정 병원체에 대한 필요한 면역 반응의 종류에 따라 다른 이펙터 기능을 가진 항체를 생산하고 있습니다. CSR과 SHM 모두 uracils 생산 DNA의 사이 토신 잔류물을 deaminates 활성화 유발 cytidine의 deaminase (AID)에 의해 시작됩니다. 이러한 uracils 결국 돌연변이와 재조합 1-3 이어지는, 복구 경로의 오류가 발생하기 쉬운 형태로 처리됩니다. SHM와 CSR의 분자 자세한 내용은 우리의 현재 이해가 생쥐의 연구 조합에서 온, 기본 셀, 셀 라인, 세포 - F합 실험. 마우스 모델은 많은 수리 요인 (예 : 엉, Msh2, Msh6, Exo1, 그리고 효소 η) 40-10 위해 중요한 역할을 보여주는 유전자 knockouts있는 황금 표준 남아 있습니다. 그러나, 모든 유전자 녹아웃 연구에 대한 의무가 있습니다. 예를 들어, 여러 번 스트랜드 브레이크 수리 단백질의 knockouts는 embryonically 치명거나 B - 세포 개발에 11-14을 손상. 또한, 때로는 SHM 또는 CSR에서 단백질의 특정 기능은 녹아웃으로 인한 더 많은 글로벌 결함에 의해 마스크 수 있습니다. 또한, 마우스의 실험 이후 셀 라인에서 개별 유전자의 표현이 후보 유전자 15-18을 식별하고 특성화하기 위해 점점 더 인기를 첫 번째 단계가되었습니다 변경, 긴 수 있습니다. 라모스는 - constitutively SHM를 겪습 Burkitt의 림프종 세포 라인 - SHM 18-24 공부를하기 위해 인기있는 세포 라인 모델을하고 있습니다. 라모스 세포 중 하나 장점은 그들이 내장된 편리한 준결승있다는 것입니다SHM의 - 양적 측정합니다. 야생 타입 세포들은 돌연변이, IgM 표현을 때려 눕힌 변이의 일부를 데리러으로 IgM을 표현합니다. 따라서, 형광 - 활성 세포 검사 (FACS)의 IgM 손실을 시금 것은 SHM의 수준에 대한 읽기 밖으로 빠르게 제공합니다. SHM보다 양적 측정은 직접 항체 유전자를 시퀀싱하여 얻을 수 있습니다. 라모스의 세포가 transfect하기가 어렵습니다 때문에, 우리는 각각 overexpression 카세트 또는 짧은 머리 핀의 자형으로 RNA (shRNA) 중 하나를 포함하는 retroviral 또는 lentiviral 구조와 세포를 감염 증가 또는 개별 유전자의 표현을 떠난 이후 안정적인 파생 상품을 생산합니다. 여기, 우리가 라모스 세포를 감염 후 SHM에서 특정 유전자 (그림 1)의 역할을 조사하기 위해 이러한 세포를 사용하는 방법에 대해 설명합니다.

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Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

우리는 overexpression 또는 shRNA 함유 인간 라모스 B - 세포주에서 어떻게 이러한 세포에 체세포 hypermutation를 측정하는 구성합니다.의 retroviral 또는 lentiviral 감염을 수행하는 방법을 설명합니다

특정 유전자의 Overexpression 또는 최저 후 라모스의 B 세포에서 체세포 Hypermutation을 평가

B cells start their life with low affinity antibodies generated by V(D)J recombination.  However, upon detecting a pathogen, the variable (V) region of an ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

B 세포의 CD40 - 정품 인증 Murine 모델

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

연구

면역학 및 감염병학

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

Murine B 세포를 정화에 유도 및 클래스 스위치 재조합 평가

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Multivirus 특정 T 세포 생성 Allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 후 바이러스 감염을 예방 / 치료

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

에 셀 운명을 따라<em&gt; E. 대장균</em&gt; 파지 람다에 의해 감염 후

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

진정한 검출 마우스 B 리니지 세포를 IgE 항체가 발현

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

표현형 및 기능 분석에 대한 검색 및 희귀의 농축 항원 특이 적 B 세포

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

희귀 한 항 원 특정 B 세포 혈액 순환에서 구별 인간 단일 클론 항 체의 생성

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding

처음 초 유 수 유 전후 개별 Oxytocin 분 비 뇌 핵 신생아 쥐에 있는 염증과 세포 스트레스 평가

The goal of this protocol is to isolate oxytocin-receptor rich brain nuclei in the neonatal brain before and after first colostrum feeding. The expression ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

분석 Murine 가장자리 지역 B 세포 생체 외에서의 전단 흐름 유도 마이그레이션

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation

면역 시 냅 스 형성 하는 동안 B 세포에서 세포 역학 공부

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both ...