Name: assessing somatic hypermutation in ramos b cells after overexpression or knockdown of specific genes
Uploaded: 2011-11-01T13:00:00
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El pMSCV-AID-I-Thy1.1 y pKat2 vectores eran una especie de regalo de la Dirección General de Schatz y el pVSV-G, PRSV Ap-, y pMDLg / pRRE vectores eran una especie de regalo de BR Cullen.

1. Preparación de muestras y las células <ol><li> Realizar una preparación mediana escala de ADN (Midiprep) de la sobre-expresión o siRNA que contienen las construcciones y la retroviral vector pKat2 envases o embalajes de los vectores lentiviral pVSV-G, pMDLg / pRRE, y PRSV-Ap 25. Use 6 mg de ADN para construir cada uno y ya sea de 4 mg de pKat2 (para las infecciones por retrovirus) o 1,5 mg de ADN de cada uno de los pVSV-g, pMDLg / pRRE, y PRSV-Rev vectores de embalaje (para las infecciones por lentiv...

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	<li>Di Noia, J. M., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+antibody+somatic+hypermutation.">Molecular mechanisms of antibody somatic hypermutation.</a> Annu. Rev. Biochem. 76, 1-22 (2007).</li><li>Peled, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biochemistry+of+somatic+hypermutation.">The biochemistry of somatic hypermutation.</a> Annu. Rev. Immunol. 26, 481-511 (2008).</li><li>Longerich, S., Basu, U., Alt, F., Storb, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AID+in+somatic+hypermutation+and+class+switch+recombination.">AID in somatic hypermutation and class switch recombination.</a> Curr. Opin. 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Immunol. 181, 7835-7842 (2008).</li><li>Dull, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system.">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).</li><li>Nakamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequency+class+switching+of+an+IgM++B+lymphoma+clone+CH12F3+to+IgA++cells.">High frequency class switching of an IgM+ B lymphoma clone CH12F3 to IgA+ cells.</a> Int. Immunol. 8, 193-201 (1996).</li><li>Muramatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+expression+of+activation-induced+cytidine+deaminase+(AID),+a+novel+member+of+the+RNA-editing+deaminase+family+in+germinal+center+B+cells.">Specific expression of activation-induced cytidine deaminase (AID), a novel member of the RNA-editing deaminase family in germinal center B cells.</a> J. Biol. Chem. 274, 18470-18476 (1999).</li></ol>

Como se mencionó anteriormente, los modelos de líneas celulares para la diversificación de anticuerpos se han convertido en un popular punto de partida para identificar nuevas proteínas que influyen en los diferentes pasos en la diversificación de anticuerpos. En este trabajo presentamos un método para el uso de la infección viral a las proteínas ya sea derribo o sobre-expresan en los Ramos de células B línea y luego examinar el impacto en SHM. Para estos estudios, que utilizan tan...

Reactivos sugiere - la mayoría de estos pueden ser sustituidos con productos similares de otros fabricantes. <table border="1" ><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th > Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td > 6-y claro TC tratados con placas </td><td > Corning </td><td> 3516 </td><td ></td></tr><tr><td > 10 ml BD Luer-Loksyringes </td><td > BD Medical </td><td > 309604 </td><td ></td></tr><tr><td> 24-alejado TC-tratados placas </td><td > Corning </td><td > 3526 </td><td></td></tr><tr><td > De 96 pocillos de poliestireno claro fondo plano TC-tratados microplacas </td><td > Corning </td><td > 3596 </td><td ></td></tr><tr><td > 100 mm TC-tratados placas de cultivo </td><td > Corning </td><td > 430167 </td><td ></td></tr><tr><td > Filtros de jeringa Acrodisc, 0,45 m </td><td > Pall Life Sciences </td><td > 4604 </td><td ></td></tr><tr><td > Agar </td><td > Teknova </td><td > A7777 </td&gt; <td ></td></tr><tr><td > Agarosa </td><td > GeneMate </td><td> E-3120-500 </td><td ></td></tr><tr><td > Ampicilina </td><td> Sigma </td><td > A0166 </td><td> 100 mg / ml en agua </td></tr><tr><td > BD FACSCanto II citómetro de flujo </td><td> BD Biosciences </td><td ></td><td > o similar </td></tr><tr><td> BD Falcon tubos redondos inferior de poliestireno </td><td> BD Biosciences </td><td > 352054 </td><td > por FACS </td></tr><tr><td > BOSC 23 celdas </td><td > ATCC </td><td > CRL-11270 </td><td ></td></tr><tr><td > CO 2 capaz de incubadora a 37 ° C </td><td ></td><td ></td><td ></td></tr><tr><td > DMEM (Dulbecco modificado de Eagle) </td><td > Sigma </td><td> D6429 </td><td ></td></tr><tr><td > FBS (suero fetal bovino) </td><td > Gemini Bio-productos </td><td > 100-106 </td><td ></td></tr><tr><td > FITC α-rata CD90/mouse CD90.1 anticuerpos </td><td > BioLegend </td><td > 202503 </td><td > FITCα-Thy1.1 </td></tr><tr><td > FuGENE 6 Transfección reactivo </td><td > Roche </td><td > 11814443001 </td><td></td></tr><tr><td > Solución tampón HEPES </td><td > Invitrogen </td><td > 15630-080 </td><td ></td></tr><tr><td > KAPA HiFi ADN polimerasa </td><td > KAPA Biosystems </td><td > KK2101 </td><td ></td></tr><tr><td > LB caldo (caldo de lisogenia - Luria) en polvo </td><td > Difco </td><td > 240230 </td><td ></td></tr><tr><td > MISIÓN TRC ARNhc acciones glicerol bacteriana </td><td > Sigma </td><td ></td><td> ARNhc vectores </td></tr><tr><td > NCS (suero de ternera recién nacido) </td><td > Gemini Bio-productos </td><td > 100-504 </td><td ></td></tr><tr><td> PBS (solución buffer fosfato) </td><td > Invitrogen </td><td> 70011 </td><td > diluye a 1x en el agua </td></tr><tr><td > PE-α humana de anticuerpos IgM </td><td > BioLegend </td><td > 314508 </td><td ></td></tr><tr><td > PGS (penicilina-estreptomicina-glutamina solución) </td><td > Gemini Bio-Productos </td><td > 400-110 </td><td ></td></tr><tr><td> Polybrene (Hexadimetrina bromuro) </td><td > Sigma </td><td > 107689 </td><td > 10 mg / ml en agua </td></tr><tr><td > PureYield plásmido sistema Midiprep </td><td > Promega </td><td > A2495 </td><td></td></tr><tr><td> Puromicina </td><td> Sigma </td><td > P8833 </td><td > 250 pg / mL en el agua </td></tr><tr><td > QIAquick gel extracción kit </td><td > QIAGEN </td><td > 28706 </td><td ></td></tr><tr><td> Ramos (AR 1) las células </td><td > ATCC </td><td > CRL-1596 </td><td ></td></tr><tr><td > RPMI-1640 </td><td > Sigma </td><td > R8758 </td><td ></td></tr><tr><td > Superíndice II </td><td > Invitrogen </td><td > 18064-022 </td><td></td></tr><tr><td > SYBR RÁPIDO qPCR kit </td><td > KAPA Biosystems </td><td > KK4601 </td><td ></td></tr><tr><td > Taq ADN polimerasa </td><td > Invitrogen </td><td > 18038-042 </td><td ></td></tr><tr><td > TOPO TA kit de clonación </td><td > In vitrogeneración </td><td > K4520-01 </td><td ></td></tr><tr><td > TRIzol </td><td > Invitrogen </td><td > 15596-026 </td><td ></td></tr><tr><td > Asistente de purificación de ADN genómico SV sistema </td><td > Promega </td><td > A2361 </td><td ></td></tr><tr><td > X-Gal [5-bromo-4-cloro-3-β-indoyl-D-galatopyranoside] </td><td > Growcells </td><td > C-5687 </td><td > 40 mg / ml en DMSO </td></tr></tbody></table>

assessing somatic hypermutation in ramos b cells after overexpression or knockdown of specific genes

Las células B comienzan su vida con los anticuerpos de baja afinidad generado por V (D) J recombinación. Sin embargo, al detectar un patógeno, la variable (V) la región de una inmunoglobulina (Ig) del gen se encuentra mutado aproximadamente 100.000 veces más que el resto del genoma a través de hipermutación somática (SHM), resultando en una alta afinidad 1,2 anticuerpos. Además, la recombinación de cambio de clase (CSR) produce anticuerpos con diferentes funciones efectoras dependiendo del tipo de respuesta inmune que se necesita para un patógeno en particular. Tanto la RSE y SHM se inician por la citidina deaminasa inducida por activación (AID), que desamina residuos de citosina en el ADN para producir uracilos. Estos uracilos son procesados ​​por las formas propenso a errores de las vías de reparación, con el tiempo provocando mutaciones y recombinación 3.1. Nuestra actual comprensión de los detalles moleculares de SHM y RSE provienen de una combinación de estudios en ratones, las células primarias, las líneas celulares, y el F-Cellexperimentos de REE. Modelos de ratones siguen siendo el estándar de oro con nocauts genética que muestra un papel crítico para la reparación de muchos factores (por ejemplo, Ung, MSH2, MSH6, Exo1, y de la polimerasa η) 4-10. Sin embargo, no todos los genes se prestan a los estudios de octavos de final. Por ejemplo, golpes de gracia de varios de doble filamento romper las proteínas de reparación son embrionariamente letal o poner en peligro el desarrollo de células B 14/11. Por otra parte, a veces la función específica de una proteína en SHM o CSR pueden estar enmascarados por más defectos global causado por el golpe de gracia. Además, puesto que los experimentos en ratones pueden ser largos, alterando la expresión de genes individuales en las líneas celulares se ha convertido en un primer paso cada vez más popular para la identificación y caracterización de genes candidatos 15-18. Ramos - un linfoma de Burkitt línea celular que constitutivamente se somete a SHM - ha sido una popular línea celular modelo para estudiar SHM 18-24. Una de las ventajas de las células de Ramos es que tienen una semi-construido en práctica-Cuantitativa medida de SHM. Las células de tipo salvaje expresa IgM y, como recogen las mutaciones, algunas de las mutaciones eliminar la expresión de IgM. Por lo tanto, analizando la pérdida de IgM mediante el escaneo de células activadas por fluorescencia (FACS) proporciona una rápida lectura para el nivel de SHM. Una medición más cuantitativa de la SHM se puede obtener por secuenciación directa de los genes de anticuerpos. Dado que las células Ramos son difíciles de transfectar, producimos derivados estables que han aumentado o reducido la expresión de un gen individual al infectar las células con las construcciones retrovirales o lentiviral que contienen un casete de sobreexpresión o una corta horquilla de ARN (siRNA), respectivamente. Aquí se describe la forma en que infectan a las células Ramos y luego utilizar estas células para investigar el papel de genes específicos en el SHM (Figura 1).

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Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

Se describe cómo realizar las infecciones por retrovirus o lentivirus de la sobreexpresión o siRNA que contienen las construcciones en la línea de Ramos humanos de células B y la forma de medir la hipermutación somática en estas células.

La evaluación de la hipermutación somática en Ramos células B después de sobreexpresión o derribo de genes específicos

B cells start their life with low affinity antibodies generated by V(D)J recombination.  However, upon detecting a pathogen, the variable (V) region of an ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

Modelo murino de CD40-activación de las células B

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Investigación

Inmunología e Infección

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

Inducción y evaluación de la recombinación de cambio de clase en las células murinas purificada B

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Generación de células T Multivirus específicos para prevenir / tratar las infecciones virales después de trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

A raíz de la celda de destino en<em&gt; E. coli</em&gt; Después de la infección por fagos Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

Detección de True IgE que expresan las células del linaje B de ratón

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Detección y enriquecimiento de Rare células B específicas de antígeno para el análisis del fenotipo y la función

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Generación de anticuerpos monoclonales humanos discriminativo de células B antígeno específicas raras circulan en sangre

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding

Evaluación de estrés celular y la inflamación en discretos núcleos de cerebro secretoras de oxitocina en la rata Neonatal antes y después de la primera alimentación de calostro

The goal of this protocol is to isolate oxytocin-receptor rich brain nuclei in the neonatal brain before and after first colostrum feeding. The expression ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Análisis de cortante inducida por el flujo de migración de las células B de zona Marginal de Murine In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation

Estudio de la dinámica de los organelos en células B durante la formación de la sinapsis inmune

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both ...