Name: expression analysis of mammalian linker-histone subtypes
Uploaded: 2012-03-19T12:00:00
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Este trabajo es apoyado por el NIH subvención GM085261 y un Premio de la Coalición de Georgia Cancer Académico Distinguido (a la fiebre amarilla).

1. Preparación de la muestra y la extracción de RNA <ol><li> Antes de la extracción de RNA, todas las superficies de trabajo y pipetas deben limpiarse con 70% de etanol y se trató con solución descontaminante RNasa, tales como la RNasa Zap. Esta práctica reduce las posibilidades de contaminación RNasa y la degradación del ARN. Use guantes para todos los procedimientos. </li><li> Para extraer el ARN de tejidos de ratón, diseccionar el órgano de interés de ratón la eutanasia, y lavar los tejidos en presencia...

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	<li>Fan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H1+linker+histones+are+essential+for+mouse+development+and+affect+nucleosome+spacing+in+vivo.">H1 linker histones are essential for mouse development and affect nucleosome spacing in vivo.</a> Mol. Cell Biol. 23, 4559-4572 (2003).</li><li>Woodcock, C. L., Skoultchi, A. I., Fan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+linker+histone+in+chromatin+structure+and+function:+H1+stoichiometry+and+nucleosome+repeat+length.">Role of linker histone in chromatin structure and function: H1 stoichiometry and nucleosome repeat length.</a> Chromosome Res. 14, 17-25 (2006).</li><li>Shen, X., Gorovsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linker+histone+H1+regulates+specific+gene+expression+but+not+global+transcription+in+vivo.">Linker histone H1 regulates specific gene expression but not global transcription in vivo.</a> Cell. 86, 475-483 (1996).</li><li>Alami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+linker-histone+subtypes+differentially+affect+gene+expression+in+vivo.">Mammalian linker-histone subtypes differentially affect gene expression in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 5920-5925 (2003).</li><li>Happel, N., Doenecke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H1+and+its+isoforms:+contribution+to+chromatin+structure+and+function.">Histone H1 and its isoforms: contribution to chromatin structure and function.</a> Gene. 431, 1-12 (2009).</li><li>Clausell, J., Happel, N., Hale, T. K., Doenecke, D., Beato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H1+subtypes+differentially+modulate+chromatin+condensation+without+preventing+ATP-dependent+remodeling+by+SWI&#47;SNF+or+NURF.">Histone H1 subtypes differentially modulate chromatin condensation without preventing ATP-dependent remodeling by SWI&#47;SNF or NURF.</a> PLoS One. 4, 0007243-0007243 (2009).</li><li>Khadake, J. R., Rao, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-+chromatin-condensing+properties+of+rat+testes+H1a+and+H1t+compared+to+those+of+rat+liver+H1bdec;+H1t+is+a+poor+condenser+of+chromatin.">DNA- chromatin-condensing properties of rat testes H1a and H1t compared to those of rat liver H1bdec; H1t is a poor condenser of chromatin.</a> Biochemistry. 34, 15792-15801 (1995).</li><li>Orrego, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+affinity+of+mammalian+histone+H1+somatic+subtypes+for+DNA+and+chromatin.">Differential affinity of mammalian histone H1 somatic subtypes for DNA and chromatin.</a> BMC Biol. 5, 22-22 (2007).</li><li>Th'ng, J. P., Sung, R., Ye, M., Hendzel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H1+family+histones+in+the+nucleus.+Control+of+binding+and+localization+by+the+C-terminal+domain.">H1 family histones in the nucleus. Control of binding and localization by the C-terminal domain.</a> J. Biol. Chem. 280, 27809-27814 (2005).</li><li>Wang, Z. F., Sirotkin, A. M., Buchold, G. M., Skoultchi, A. I., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+histone+H1+genes:+gene+organization+and+differential+regulation.">The mouse histone H1 genes: gene organization and differential regulation.</a> J. Mol. Biol. 271, 124-138 (1997).</li><li>Brown, D. T., Sittman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+through+overexpression+and+tagging+of+the+variant+type+of+the+mouse+H1e+and+H1c+genes.">Identification through overexpression and tagging of the variant type of the mouse H1e and H1c genes.</a> J. Biol. Chem. 268, 713-718 (1993).</li><li>Fan, Y., Sirotkin, A., Russell, R. G., Ayala, J., Skoultchi, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+somatic+H1+subtypes+are+dispensable+for+mouse+development+even+in+mice+lacking+the+H1(0)+replacement+subtype.">Individual somatic H1 subtypes are dispensable for mouse development even in mice lacking the H1(0) replacement subtype.</a> Mol. Cell. Biol. 21, 7933-7943 (2001).</li><li>Fan, Y., Skoultchi, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+H1+linker+histone+subtypes+and+their+functions+in+mice.">Genetic analysis of H1 linker histone subtypes and their functions in mice.</a> Methods Enzymol. 377, 85-107 (2004).</li><li>Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+quantitative+PCR.">Real time quantitative PCR.</a> Genome Res. 6, 986-994 (1996).</li></ol>

El conjunto de ensayos que aquí se presenta permitir el análisis exhaustivo de los niveles de expresión de mamíferos subtipos de histonas linker. Correctamente diseñados QRT-PCR proporcionar mediciones de alta sensibilidad y precisión de los mensajes de ARN de los genes histona H1 de mamífero. La parte crítica de la QRT-PCR para los genes del subtipo enlazador histonas es la preparación de cDNA utilizando cebadores aleatorios basados ​​en la transcripción inversa. ARNm de genes más histonas, incluyendo lo...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> RNasa Zap </td><td> Applied Biosystems </td><td> AM9780 </td></tr><tr><td> Reactivo Trizol </td><td> Invitrogen </td><td> 15596-018 </td></tr><tr><td> SuperScriptIII </td><td> Invitrogen </td><td> 18080-051 </td></tr><tr><td> Etanol absoluto </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2818-4 </td></tr><tr><td> IQ SYBR Green </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-8880 </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> Desoxirribonucleasa I </td><td> Sigma </td><td> AMP-D1 </td></tr><tr><td> Microseal placas de 96 pocillos PCR </td><td> Bio-Rad </td><td> MSP-9605 </td></tr><tr><td> Los sellos adhesivos &#39;B&#39; Microseal </td><td> Bio-Rad </td><td> MSB-1001 </td&gt; </tr><tr><td> Sacarosa </td><td> Agros Organics </td><td> AC40594 </td></tr><tr><td> El fosfato de sodio dibásico heptahidratado (Na 2 HPO 4 · 7H 2 O) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP332 </td></tr><tr><td> Cloruro sódico (NaCl) </td><td> América Bioanalítica </td><td> AB01915 </td></tr><tr><td> Dihidrógeno de sodio heptahidratado (NaH 2 PO 4 · 7H2O) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP-330 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP310 </td></tr><tr><td> Completa el inhibidor de la proteasa cóctel mini tablet </td><td> Roche Ciencias Aplicadas </td><td> 11836153001 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E-5134 </td></tr><tr><td> Fenilmetanosulfonilo fluoruro (PMSF) </td><td> América Bioanalítica </td><td> AB01620 </td></tr><tr><td> Nonidet-40 (NP-40) </td&gt; <td> América Bioanalítica </td><td> AB01425 </td></tr><tr><td> El cloruro de potasio (KCL) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP366 </td></tr><tr><td> Tris [hidroximetil aminometano] </td><td> América Bioanalítica </td><td> AB02000 </td></tr><tr><td> Cloruro de magnesio (MgCl2) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP214 </td></tr><tr><td> El ácido sulfúrico (H2SO4) </td><td> VWR </td><td> VW3648-3 </td></tr><tr><td> De hidróxido de amonio (NH 4 OH) </td><td> Agros Organics </td><td> AC42330 </td></tr><tr><td> Bradford ensayo de proteínas </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0001 </td></tr><tr><td> Acetonitrilo </td><td> EMD </td><td> AX0145-1 </td></tr><tr><td> Ácido trifluoroacético (TFA) </td><td> JT Baker </td><td> 9470-01 </td></tr></tbody></table>

expression analysis of mammalian linker-histone subtypes

Histona H1 vinculador se une a la partícula central del nucleosoma y el ADN enlazador, lo que facilita el plegamiento de la cromatina en la estructura de orden superior. H1 es esencial para el desarrollo de mamíferos 1 y regula la expresión de genes específicos in vivo 2-4. Entre las proteínas histonas altamente conservadas, la familia de las histonas H1 linker es el grupo más heterogéneo. Hay 11 subtipos H1 en los mamíferos que son regulados diferencialmente durante el desarrollo y en diferentes tipos celulares. Estos subtipos H1 H1 somáticas son: 5 (H1a-e), el reemplazo de H1 0, 4 subtipos de células germinales específicos H1, ​​y H1X 5. La presencia de los subtipos H1 múltiples que difieren en su afinidad de unión al ADN y la capacidad de compactación de la cromatina 6.9 proporciona un nivel adicional de modulación de la función de la cromatina. Así, el análisis cuantitativo de expresión de los subtipos H1 individuales, tanto de ARNm y proteínas, es necesario para una mejor comprensión de la regulación de la mayorPara estructura de la cromatina y la función. Aquí se describe una serie de ensayos diseñados para el análisis de los niveles de expresión de los subtipos H1 individuales (Figura 1). la expresión de mRNA de varios genes H1 variante se mide por un conjunto de alta sensibilidad y cuantitativa de la PCR con transcripción inversa (QRT-PCR), que son más rápidos, más precisos y requieren muestras y mucho menos en comparación con el enfoque alternativo de análisis de Northern blot. A diferencia de la mayoría de los otros mensajes de ARNm celulares, ARNm para genes de la mayoría de las histonas, incluyendo la mayoría de los genes H1, ​​carecen de una larga cola poli, pero contienen una estructura tallo-bucle en la región 3 &#39;no traducida (UTR) 10. Por lo tanto, los ADNc se preparó a partir de ARN total por transcripción inversa usando cebadores al azar en lugar de cebadores oligo-dT. En tiempo real ensayos de PCR con primers específicos para cada uno de los subtipos H1 (Tabla 1) se llevan a cabo para obtener la medición altamente cuantitativa de los niveles de mRNA de subtipo H1 personas. La expresión de los genes de limpieza se analizan como controles para la normalización. La abundancia relativa de las proteínas de cada subtipo H1 y histonas se obtiene mediante cromatografía líquida en fase inversa de alto rendimiento (CLAR) de análisis de las histonas total extraído de células de mamífero 11-13. El método HPLC y condiciones de elución descrito aquí dan separaciones óptimas de los subtipos H1 del ratón. Al cuantificar el perfil de HPLC, se calcula la proporción relativa de los subtipos H1 H1 individuales dentro de la familia, así como determinar la relación entre nucleosoma H1 en las células.

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Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes

Se describe un conjunto de ensayos para analizar los niveles de expresión de las histonas H1 enlazador. ARNm de genes H1 individuales se mide cuantitativamente por transcripción inversa aleatoria cebador basado seguido por PCR en tiempo real, mientras que la cuantificación de proteínas de las histonas H1 se logra mediante análisis por HPLC.

Análisis de Expresión de mamíferos enlazador histonas subtipos

Linker histone H1 binds to the nucleosome core particle and linker DNA, facilitating folding of chromatin into higher order structure.  H1 is essential ...

Research

JoVE Journal

Biology

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Gen bacteriano y Análisis de Expresión El uso de microarrays

Investigación

Biología

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

La preparación de cultivos primarios de células hematopoyéticas de la médula ósea murina por electroporación

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Tinción de las proteínas en geles con Coomassie G-250, sin ácido disolvente orgánico y el acético

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Utilizando el sistema de electroporación Gene Emisores MXcell para transfectar células primarias con alta eficiencia

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Pulso-caza de análisis de cadenas de azúcares unidos a N de glicoproteínas en células de mamífero

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

El uso de un contador de células automatizado para simplificar estudios de expresión génica: siRNA Derribo de IL-4 la expresión génica en células dependientes Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

El análisis de ADN de doble cadena Break (OSD) de reparación en células de mamífero

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Mutagénesis y análisis funcional de los canales iónicos heteróloga se expresa en células de mamífero

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

Análisis de la cinética de exportación nuclear de ARNm en células de mamífero por microinyección

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Análisis de la posición del ciclo celular en células de mamífero

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...