Name: a functional motor unit in the culture dish: co-culture of spinal cord explants and muscle cells
Uploaded: 2012-04-12T12:00:00
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Nosso trabalho é apoiado pela National Science Foundation suíço (SNF), a Iniciativa Suíça em Biologia de Sistemas (SystemsX.ch), a Muscular Dystrophy Association EUA (MDA), a Associação Française contre les Miopatias (AFM), o United mitocondrial Doença Fundação (UMDF), a Gebert-Ruf Fundação Programa das Doenças Raras (GRF), a Sociedade Suíça de Investigação das doenças musculares (SSEM / FSRMM), a Swiss Life &quot;Jubiläumsstiftung für Volksgesundheit und Forschung medizinische&quot;, a Roche Research Foundation e da Universidade de Basileia.

1. Preparação da cultura de células humanas muscular primária <ol><li> Estabelecer as culturas de células humanas musculares de acordo com a técnica de explante-re explante-4. Primeiro, remova não-tecido muscular das biópsias. Em seguida, incorporar 1 mm 3 explantes musculares em um coágulo de plasma, que permite que os fibroblastos de emergir dos explantes. </li><li> Os explantes incorporados são transferidos para um prato de plasma gelatina revestido e deixá-los crescer em meio de cr...

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	<li>Delaporte, C., Dautreaux, B., Fardeau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+myotube+differentiation+in+vitro+in+different+culture+conditions.">Human myotube differentiation in vitro in different culture conditions.</a> Biol. Cell. 57, 17-22 (1986).</li><li>Kobayashi, T., Askanas, V., Engel, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+muscle+cultured+in+monolayer+and+cocultured+with+fetal+rat+spinal+cord:+importance+of+dorsal+root+ganglia+for+achieving+successful+functional+innervation.">Human muscle cultured in monolayer and cocultured with fetal rat spinal cord: importance of dorsal root ganglia for achieving successful functional innervation.</a> J. Neurosci. 7, 3131-3141 (1987).</li><li>Braun, S., Croizat, B., Lagrange, M. C., Warter, J. M., Poindron, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+muscular+abnormalities+in+culture+in+spinal+muscular+atrophy.">Constitutive muscular abnormalities in culture in spinal muscular atrophy.</a> Lancet. 345, 694-695 (1995).</li><li>Askanas, V., Engel, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+program+for+investigating+adult+human+skeletal+muscle+grown+aneurally+in+tissue+culture.">A new program for investigating adult human skeletal muscle grown aneurally in tissue culture.</a> Neurology. 25, 58-67 (1975).</li><li>Guettier-Sigrist, S., Coupin, G., Warter, J. M., Poindron, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+types+required+to+efficiently+innervate+human+muscle+cells+in+vitro.">Cell types required to efficiently innervate human muscle cells in vitro.</a> Exp. Cell Res. 259, 204-212 (2000).</li><li>Lefebvre, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+spinal+muscular+atrophy-determining+gene.">Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene.</a> Cell. 80, 155-165 (1995).</li><li>Schrank, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+the+survival+motor+neuron+gene,+a+candidate+gene+for+human+spinal+muscular+atrophy,+leads+to+massive+cell+death+in+early+mouse+embryos.">Inactivation of the survival motor neuron gene, a candidate gene for human spinal muscular atrophy, leads to massive cell death in early mouse embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 9920-9925 (1997).</li><li>Hsieh-Li, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+spinal+muscular+atrophy.">A mouse model for spinal muscular atrophy.</a> Nat. Genet. 24, 66-70 (2000).</li><li>Monani, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+centromeric+survival+motor+neuron+gene+(SMN2)+rescues+embryonic+lethality+in+Smn(-/-)+mice+and+results+in+a+mouse+with+spinal+muscular+atrophy.">The human centromeric survival motor neuron gene (SMN2) rescues embryonic lethality in Smn(-/-) mice and results in a mouse with spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 9, 333-339 (2000).</li><li>Sleigh, J. N., Gillingwater, T. H., Talbot, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+mouse+models+to+understanding+the+pathogenesis+of+spinal+muscular+atrophy.">The contribution of mouse models to understanding the pathogenesis of spinal muscular atrophy.</a> Dis. Model. Mech. 4, 457-467 (2011).</li><li>Durbeej, M., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscular+dystrophies+involving+the+dystrophin-glycoprotein+complex:+an+overview+of+current+mouse+models.">Muscular dystrophies involving the dystrophin-glycoprotein complex: an overview of current mouse models.</a> 12, 349-361 (2002).</li><li>Schnabel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroscience:+Standard+model.">Neuroscience: Standard model.</a> Nature. 454, 682-685 (2008).</li><li>Benatar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lost+in+translation:+treatment+trials+in+the+SOD1+mouse+and+in+human+ALS.">Lost in translation: treatment trials in the SOD1 mouse and in human ALS.</a> Neurobiol. Dis. 26, 1-13 (2007).</li><li>Dorchies, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+innervation+and+differentiation+of+X-linked+myotubular+myopathy+muscle+cells+in+a+nerve-muscle+coculture+system.">Normal innervation and differentiation of X-linked myotubular myopathy muscle cells in a nerve-muscle coculture system.</a> Neuromuscul. Disord. 11, 736-746 (2001).</li><li>McFerrin, J., Engel, W. K., Askanas, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+innervation+of+cultured+human+muscle+overexpressing+betaAPP+experimentally+and+genetically:+relevance+to+inclusion-body+myopathies.">Impaired innervation of cultured human muscle overexpressing betaAPP experimentally and genetically: relevance to inclusion-body myopathies.</a> Neuroreport. 9, 3201-3205 (1998).</li></ol>

Uma ferramenta fisiológica in vitro para estudar a função da célula muscular em contexto normal e patológico é do maior interesse para os myologists, porque as culturas de células musculares geralmente não recapitular a importância de várias células e células do tipo conexões. A adição de neurónios motores purificado para as células musculares não é suficiente para alcançar uma unidade de motor funcional uma vez que a presença de células de Schwann é necessária para a inervação para se...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 14170 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 31095 </td></tr><tr><td> Meio 199 </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 31153 </td></tr><tr><td> Soro Fetal Bovino </td><td> Fetal Clone Perbio </td><td> SH30066.03 </td></tr><tr><td> Insulina </td><td> Sigma </td><td> I9278 </td></tr><tr><td> EGF humano </td><td> Sigma </td><td> E9644 </td></tr><tr><td> FGF humano </td><td> Sigma </td><td> F0291 </td></tr><tr><td> A penicilina / estreptomicina solução </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td></tr></tbody></table>

a functional motor unit in the culture dish: co-culture of spinal cord explants and muscle cells

Humanos células musculares primárias cultivadas em monocamada aneurally raramente contrato espontaneamente, porque, na ausência de um componente do nervo, diferenciação celular é limitada e motor estimulação neuronal está ausente 1. Estas limitações dificultar o estudo in vitro de muitas doenças neuromusculares em células musculares em cultura. Importante, as restrições experimentais de monolayered, células musculares em cultura pode ser superado pela inervação funcional de miofibras com explantes da medula espinal em co-cultura. Aqui, nós mostram os diferentes passos necessários para atingir um inervação, eficiente adequado de células musculares humanos primários, levando à completa contracção diferenciação e de fibras de acordo com o método desenvolvido por Askanas 2. Para fazer isso, as células musculares são co-cultivadas com explantes espinal medula de embriões de ratos em ED 13,5, com o gânglio da raiz dorsal ainda ligado às fatias de medula espinhal. Depois de alguns dias, o músculo fibros começar a contrato e, eventualmente, tornar-se cruz-estriado através inervação por neurites funcionais projetando a partir dos explantes da medula espinhal que ligam para as células musculares. Esta estrutura pode ser mantida durante vários meses, simplesmente por troca regular do meio de cultura. As aplicações desta ferramenta de valor inestimável são numerosas, pois representa um modelo funcional para análises multidisciplinares de desenvolvimento muscular humana e inervação. Na verdade, uma completa de novo instalação junção neuromuscular ocorre em um prato de cultura, permitindo uma fácil medição de muitos parâmetros em cada passo, num contexto fundamental e fisiológico. Só para citar alguns exemplos, genômicos e / ou estudos de proteômica pode ser realizada diretamente sobre as co-culturas. Além disso, os efeitos pré e pós-sináptica pode ser e especificamente avaliados separadamente na junção neuromuscular, porque ambos os componentes vêm de diferentes espécies,de rato e humano, respectivamente. O nervo músculo-co-cultura pode também ser realizada com células musculares humanas isoladas de pacientes que sofrem de músculo ou doenças neuromusculares 3, e assim pode ser usado como uma ferramenta de rastreio de drogas candidatas. Finalmente, nenhum equipamento especial, mas uma instalação de BSL2 regular é necessária para reproduzir uma unidade de motor funcional em um prato de cultura. Este método, assim, é valiosa para ambos o músculo, bem como as comunidades de investigação neuromusculares para estudos fisiológicos e mecanicista da função neuromuscular, num contexto normal e doença.

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A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Células musculares cultivadas são um modelo inadequado para recapitular músculo inervado<em&gt; In vivo</em&gt;. Uma unidade de motor funcional pode ser reproduzida<em&gt; In vitro</em&gt; Por inervação diferenciados humanos células musculares de ratos embrionários primários usando explantes da medula espinhal. Este artigo descreve como co-culturas de explantes da espinal medula e células musculares são estabelecidos.

A Unidade Funcional Motor na placa de cultura: Co-cultivo de explantes da Medula Espinhal e as células musculares

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissecção e Cultura de Neurônios da Medula Espinhal comissural embrionárias

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Neurociência

Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

Dissecção e Cultura do Gânglio pintainho Statoacoustic e Explantes da Medula Espinhal em géis de colágeno para Ensaios crescimento de neuritos

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation ...

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Embrião de galinha Spinal Cord Protocolo Cultura Slice

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Análise de Desenvolvimento de dente Germ Innervation Utilizar dispositivos microfluídicos Co-cultura

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

zebrafish<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Preparação para gravações eletrofisiológicas da Spinal Sensorial e Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

Isolamento e cultura de neurônios da medula espinhal de ratos neonatais

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

Implante de janela de laminectomia e medula espinhal no mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Identificando marcadores de superfície celular da haste neural primária e células progenitoras por rotulagem metabólica de Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...

Direct Injection of a Lentiviral Vector Highlights Multiple Motor Pathways in the Rat Spinal Cord

Injeção direta de um vetor de Lentivirus destaca várias vias motoras na medula espinhal de ratos

Introducing proteins of interest into cells in the nervous system is challenging due to innate biological barriers that limit access to most molecules. ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversão de pilhas de haste pluripotentes induzidas humanas (iPSCs) em neurônios de motor espinal e craniano funcionais usando vetores de PiggyBac

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...