Name: methods for study of neuronal morphogenesis: ex vivo rnai electroporation in embryonic murine cerebral cortex
Uploaded: 2012-05-18T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex at JoVE.com

Agradecemos a la Dra. Shirin Bonni para proporcionar la construcción pSil-GFP, el Dr. Alper Uzun para la ilustración de la Figura 1, y la instalación de Bioimagen Leduc para la microscopía confocal. EMM es apoyado por el premio a la Trayectoria para la ciencia médica con cargo al Fondo Burroughs Wellcome, un premio NARSAD de Jóvenes Investigadores, y el NIH CNRR COBRE RR018728 P20-01. SBL es apoyado por el NIH CNRR COBRE RR018728 P20-01, y ha recibido el apoyo de PHS NRSA 5T32MH019118-20.

1. Preparación de Soluciones de Cultura y Medios de Comunicación (no en el vídeo) <ol><li> Preparar 1 litro de solución salina equilibrada completa de Hank (HBSS) que contiene HBSS 1x, 2.5 mM HEPES (pH 7,4), 30 mM de D-glucosa, 1 mM CaCl 2, 1 mM de MgSO 4 y 4 mM NaHCO 3. Agregue el agua doblemente destilada (DDC 2 O). Filtrar con un filtro de esterilización de 0,2 micras y se almacena a 4 º C. </li><li> Para preparar el medio de cultivo utilizando rebanada 35 ml de Med...

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	<li>Angevine, J. B., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoradiographic+study+of+cell+migration+during+histogenesis+of+cerebral+cortex+in+the+mouse.">Autoradiographic study of cell migration during histogenesis of cerebral cortex in the mouse.</a> Nature. 192, 766-766 (1961).</li><li>Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+neuronal+migration+in+the+embryonic+cortex.">Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex.</a> Trends Neurosci. 27, 392-392 (2004).</li><li>Barnes, A. P., Polleux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+axon-dendrite+polarity+in+developing+neurons.">Establishment of axon-dendrite polarity in developing neurons.</a> Annu. Rev. Neurosci. 32, 347-347 (2009).</li><li>Haydar, T. F., Bambrick, L. L., Krueger, B. K., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+for+analysis+of+proliferation,+cell+death,+and+migration+in+the+embryonic+neocortex.">Organotypic slice cultures for analysis of proliferation, cell death, and migration in the embryonic neocortex.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 425-425 (1999).</li><li>Polleux, F., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slice+overlay+assay:+a+versatile+tool+to+study+the+influence+of+extracellular+signals+on+neuronal.">The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal.</a> Sci. STKE. 2002, pl9-pl9 (2002).</li><li>Guerrier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F-BAR+domain+of+srGAP2+induces+membrane+protrusions+required+for+neuronal+migration+and+morphogenesis.">The F-BAR domain of srGAP2 induces membrane protrusions required for neuronal migration and morphogenesis.</a> Cell. 138, 990-990 (2009).</li><li>Stegmuller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-intrinsic+regulation+of+axonal+morphogenesis+by+the+Cdh1-APC+target+SnoN.">Cell-intrinsic regulation of axonal morphogenesis by the Cdh1-APC target SnoN.</a> Neuron. 50, 389-389 (2006).</li><li>Sepp, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+neural+outgrowth+genes+using+genome-wide+RNAi.">Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi.</a> PLoS Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).</li><li>Konishi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdh1-APC+controls+axonal+growth+and+patterning+in+the+mammalian+brain.">Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain.</a> Science. 303, 1026-1026 (2004).</li><li>Vankelecom, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+and+paraffin-embedding+of+mouse+tissues+for+GFP+visualization.">Fixation and paraffin-embedding of mouse tissues for GFP visualization.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009, 5298-5298 (2009).</li><li>Hand, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+Neurogenin2+specifies+the+migration+properties+and+the+dendritic+morphology+of+pyramidal+neurons+in+the+neocortex.">Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex.</a> Neuron. 48, 45-45 (2005).</li><li>Taniguchi, Y., Young-Pearse, T., Sawa, A., Kamiya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Utero+Electroporation+as+a+Tool+for+Genetic+Manipulation+in+Vivo+to+Study+Psychiatric+Disorders:+From+Genes+to+Circuits+and+Behaviors.">In Utero Electroporation as a Tool for Genetic Manipulation in Vivo to Study Psychiatric Disorders: From Genes to Circuits and Behaviors.</a> Neuroscientist. 18, 169-179 (2012).</li></ol>

Estos métodos implican la electroporación ex vivo de los plásmidos que codifican ARN bicatenario horquillas 8 y la cultura de rebanadas organotípicos 4 proporcionan varias ventajas distintas. En primer lugar, estos métodos permiten una evaluación rápida de RNAi derivados de fenotipos. La inclusión de una expresión que codifica GFP cassette en el vector pSilencer mismo que contiene el promotor U6 que impulsa la doble cadena de ARN horquilla permite una rápida identificación y car...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Hamilton jeringa </td><td> HAMILTON </td><td> 80008 </td><td> 31 de calibre 0,5 pulgadas de largo, PT-4 (nivel de biselado punto), el volumen de 10ul </td></tr><tr><td> Tweezertrodes Platinum </td><td> BTX </td><td> 45-0489 </td><td> Tamaño de 5mm </td></tr><tr><td> ECM830 electroporador </td><td> BTX </td><td> 45-0002 </td><td></td></tr><tr><td> BTX pedal </td><td> BTX </td><td> 45-0208 </td><td> Para el uso con ECM830 electroporador </td></tr><tr><td> Vibrante microtomo la hoja </td><td> LEICA </td><td> VT1000 S </td><td></td></tr><tr><td> 6 - plato bien para su uso con insertos </td><td> FALCON </td><td> 353502 </td><td> Contiene muescas para encajar insertos </td></tr><tr><td> Insertos de cultivo de tejidos </td><td> FALCON </td><td> 353090 </td><td> 0,4 micrómetros </td&gt; </tr><tr><td> Fast Green </td><td> SIGMA </td><td> F7252 </td><td></td></tr><tr><td> Agarosa de bajo de fusión </td><td> FISHER </td><td> BP165-25 </td><td> ADN de grado </td></tr><tr><td> La laminina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L2020 </td><td></td></tr><tr><td> Poli-L-lisina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P5899 </td><td></td></tr><tr><td> Medio Basal de Eagle </td><td> Sigma Aldrich </td><td> B-1522 </td><td></td></tr><tr><td> 10x HBSS sin Ca y Mg </td><td> GIBCO </td><td> 14180-046 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES libre de ácido </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H4034 </td><td></td></tr></tbody></table>

methods for study of neuronal morphogenesis: ex vivo rnai electroporation in embryonic murine cerebral cortex

La corteza cerebral dirige las funciones cognitivas superiores. Esta estructura seis capas se genera en el interior de un primer, fuera-última forma, en el que las neuronas primeros nacidos permanecen más cerca al ventrículo, mientras que las neuronas últimos nacidos migran más allá de las neuronas primeros nacidos hacia la superficie del cerebro 1. Además de la migración neuronal 2, un proceso clave para la función cortical normal es la regulación de la morfogénesis neuronal 3. Si bien la morfogénesis neuronal puede ser estudiado in vitro en cultivos primarios, hay mucho que aprender de cómo estos procesos están regulados en los entornos de tejidos. Se describen las técnicas para analizar la migración neuronal y / o la morfogénesis en rodajas organotípicos de la corteza cerebral 4,6. Un vector pSilencer modificado se usa que contiene tanto un promotor U6 que impulsa el ARN de doble hebra de horquilla y un casete de expresión independiente que codifica la proteína GFP impulsado bya promotor CMV 7-9. Nuestro enfoque permite la evaluación rápida de los defectos en el crecimiento de las neuritas en caída específica de genes candidatos y ha sido utilizado con éxito en una pantalla para que los reguladores de crecimiento de las neuritas 8. Debido a que sólo un subconjunto de células se expresan las construcciones RNAi, las rebanadas organotípicos permitir un análisis del mosaico de los fenotipos posibles. Además, debido a este análisis se realiza en una aproximación cercana del entorno in vivo, que proporciona un bajo coste y rápida alternativa para la generación de animales transgénicos o knockout para los genes de función desconocida cortical. Finalmente, en comparación con la tecnología de electroporación in vivo, el éxito de los ex experimentos in vivo electroporación no depende de desarrollo proficiente habilidad cirugía y se puede realizar con un tiempo de formación más cortos y habilidad.

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Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Para llevar a cabo una evaluación rápida de la función de los genes en el desarrollo de la corteza cerebral, se describen procedimientos que implican la<em&gt; Ex vivo</emElectroporación&gt; de plásmidos co-expresión de inhibitoria ARN (RNAi), y las buenas prácticas agrarias en la corteza de embriones de ratón. Este protocolo se presta al estudio de diversos aspectos de neurodesarrollo, tales como la neurogénesis, la migración neuronal y la morfogénesis neuronal incluida la dendrita y axón.

Métodos de estudio de la morfogénesis neuronal:<em&gt; Ex vivo</em&gt; RNAi electroporación en la corteza cerebral embrionario murino

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

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The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

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Electroencefalografía simultánea, en tiempo real Medición de la concentración de lactato y Manipulación optogenético de la actividad neuronal en la corteza cerebral de roedores

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

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Dos registros electrofisiológicos de sinápticamente respuestas evocadas neuronal y astroglial en agudas rodajas de hipocampo

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Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

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Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

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In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

La electroporación en el útero métodos para estudiar la excitabilidad de las subpoblaciones neuronales y Conectividad Una sola célula

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

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Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Ex útero Electroporación y culturas Organotypic rebanada de cerebros embrionarios de ratón para vivir-la proyección de imagen de interneuronas GABAérgicas de migrando

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...