Name: simple and robust in vivo and in vitro approach for studying virus assembly
Uploaded: 2012-03-01T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly at JoVE.com

De auteurs willen graag een aantal leden van het lab bedanken voor hun waardevolle suggesties in de ontwikkeling van agroinfiltration en in vitro assemblage assays. Dit werk werd gefinancierd door een subsidie ​​van de Universiteit van Californië. Deze studie werd ondersteund in delen door een subsidie ​​van de National Science Foundation (cbet-1144237).

1. Plantaardig materiaal <ol><li> Nicotiana benthamiana planten worden in de encapsideringssequenties test moet bij 4 bladeren fase (ongeveer 3-4 weken oude planten). </li></ol> 2. Levering en expressie van functionele virale genoom componenten naar de cellen te planten door agroinfiltration <ol><li> Dag 1: Agrobacterium-stam (bijv. EH 105 of GV 3101) herbergen de pCass-BMV RNA 1, BMV RNA 2 en BMV RNA 3 1,2 gekweekt op LB-agarplaten aangevuld met 50 mg / m...

<ol>
	<li>Annamalai, P., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-independent+expression+of+genome+components+and+capsid+protein+of+brome+mosaic+virus+in+planta:+a+functional+role+for+viral+replicase+in+RNA+packaging.">Replication-independent expression of genome components and capsid protein of brome mosaic virus in planta: a functional role for viral replicase in RNA packaging.</a> Virology. 338, 96-111 (2005).</li><li>Annamalai, P., Rofail, F., Demason, D. A., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-coupled+packaging+mechanism+in+positive-strand+RNA+viruses:+synchronized+coexpression+of+functional+multigenome+RNA+components+of+an+animal+and+a+plant+virus+in+Nicotiana+benthamiana+cells+by+agroinfiltration.">Replication-coupled packaging mechanism in positive-strand RNA viruses: synchronized coexpression of functional multigenome RNA components of an animal and a plant virus in Nicotiana benthamiana cells by agroinfiltration.</a> J. Virol. 82, 1484-1495 (2008).</li><li>Annamalai, P., Rao, A. L., Foster, N., Johansen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plant Virology Protocols. 451, 251-264 (2008).</li><li>Lane, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bromoviruses.">The bromoviruses.</a> Adv. Virus Res. 19, 151-220 (1974).</li><li>Choi, Y. G., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+studies+on+bromovirus+capsid+protein.+VII.+Selective+packaging+on+BMV+RNA4+by+specific+N-terminal+arginine+residuals.">Molecular studies on bromovirus capsid protein. VII. Selective packaging on BMV RNA4 by specific N-terminal arginine residuals.</a> Virology. 275, 207-217 (2000).</li><li>Sambrrok, J., Russel, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , (2001).</li><li>Dreher, T. W., Rao, A. L., Hall, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+in+vivo+of+mutant+brome+mosaic+virus+RNAs+defective+in+aminoacylation.">Replication in vivo of mutant brome mosaic virus RNAs defective in aminoacylation.</a> J. Mol. Biol. 206, 425-438 (1989).</li><li>Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+nano-constructs+composed+of+genome-depleted+brome+mosaic+virus+doped+with+a+near+infrared+chromophore+for+potential+biomedical+applications.">Optical nano-constructs composed of genome-depleted brome mosaic virus doped with a near infrared chromophore for potential biomedical applications.</a> A.C.S. Nano. 5, 1243-1252 (2011).</li><li>Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viral+movement+protein+prevents+spread+of+the+gene+silencing+signal+in+Nicotiana+benthamiana.">A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana.</a> Cell. 103, 157-167 (2000).</li><li>Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Agrobacterium-mediated+transient+assays+of+gene+expression+in+lettuce,+tomato+and+Arabidopsis.">Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis.</a> Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).</li></ol>

Agroinfiltration hier gepresenteerde benadering op grote schaal kunnen worden toegepast op een breed scala van plantenvirussen. Een kenmerk kenmerk van deze benadering is gesynchroniseerd levering van meerdere agroconstruct naar dezelfde cel-een groot nadeel vaak geassocieerd met routinematig mechanische inoculatie van plantenvirussen. In vivo en in vitro studies montage met broom mosaic virus als model kan doelmatig worden uitgevoerd door volgen enkele tips. (i) Voor een succesvolle infiltratie van <e...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> MES Natriumzouten </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2993 </td></tr><tr><td> Indocyaninegroen </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I2633 </td></tr><tr><td> Beekman ultracentrifuge </td><td> Beckman Coulter </td><td> Model: L8-70M </td></tr><tr><td> Centricon-100 kolom </td><td> Millipore </td><td> YM-100 </td></tr><tr><td> Spectrofotometer </td><td> Cary 50 Varian Inc </td><td> Onderdeelnummer 10068900 </td></tr><tr><td> Spectrofluorometer </td><td> Fluorolog 3, Jobin-Yvon. </td><td> Onderdeelnummer FL3-21 </td></tr></tbody></table>

simple and robust in vivo and in vitro approach for studying virus assembly

In virussen met een positieve-sense RNA genoom pathogeen zijn voor mens, dier en plant, nageslacht ingepakt in volwassen en stabiel virionen is een kardinale fase tijdens de oprichting van de infectie in een bepaalde host. Bijgevolg, studie van inkapseling ontcijfert de informatie met betrekking tot de know-how van het mechanisme reguleren virus assemblage van infectueuze virionen te vormen. Dergelijke informatie is van vitaal belang bij het formuleren van nieuwe methoden voor het terugdringen van het virus verspreiding van ziekten en plagen. Virus inkapseling kan worden bestudeerd in vivo en in vitro. Genoom inkapseling in vivo is een sterk gereguleerde selectief proces, waarbij macromoleculaire interacties en subcellulaire verkokering. Daarom studie die leidt tot ontleden gebeurtenissen omvat virus inkapseling in vivo zou basiskennis te bieden om te begrijpen hoe virussen zich vermenigvuldigen en te monteren. Onlangs in vitro inkapseling is benut voor het onderzoek op het gebied van biomedische imaGing en therapeutische toepassingen. Niet-omhulde plantenvirussen staan ​​ver vooruit in de onderneming van in vitro inkapseling van de negatief geladen vreemd materiaal. Brome mosaic virus (BMV), een niet-omhulde multicomponent RNA virus pathogeen planten werd gebruikt als modelsysteem voor het bestuderen genoom verpakking in vivo en in vitro. Voor encapsidering assays in Nicotiana benthamiana planten Agrobacterium-gemedieerde transiënte expressie, noemen agroinfiltration, is een efficiënte en robuuste techniek voor de gesynchroniseerde leveren en expressie van meerdere componenten dezelfde cel. In deze benadering wordt een schorsing van Agrobacterium tumefaciens cellen die binair plasmide vectoren die cDNA&#39;s van desiredviral mRNA&#39;s geïnfiltreerd in de intercellulaire ruimte withina blad met niets meer verfijnd dan een 1 ml wegwerpspuit (zonder naald). Dit leidt tot de overdracht van DNA insert in plantencellen, de T-DNAinsert blijft tijdelijk in de kern en wordt getranscribeerd door de gastheer polymerase II, leiden tot de transiënte expressie. De resulterende mRNA transcript (capped en gepolyadenyleerde) wordt vervolgens geëxporteerd naar het cytoplasma voor de vertaling. Na ongeveer 24 tot 48 uur incubatie, kunnen delen van geïnfiltreerde bladeren worden bemonsterd voor microscopyor biochemische analyses. Agroinfiltration maakt grote aantallen (honderden tot duizenden) cellen gelijktijdig getransfecteerd. Voor in vitro encapsideringssignaal gezuiverd virions van BMV worden gescheiden in capside-eiwit door dialyseren tegen dissociatie buffer met calciumchloride gevolgd door verwijdering van RNA en niet-gedissocieerd virions door centrifugeren. Genoom verarmd capside-eiwit subeenheden vervolgens weer met de gewenste virale genoom onderdelen of niet-virale componenten zoals indocyanine kleurstof.

Watch this Scientific Journal Video about Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly at JoVE.com

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

Een eenvoudige, efficiënte en robuuste manier om de levering van meerdere virale componenten synchroniseren met plantencellen via<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Gemedieerde transiënte expressie beschreven. Deze aanpak is vatbaar voor het bestuderen van replicatie, inkapseling gevolgd door<em&gt; In vitro</em&gt; Montage van niet-virale componenten in het genoom van uitgeput optische virale geesten die geschikt zijn voor biomedische toepassingen.

Eenvoudige en robuuste In vivo En In vitro Aanpak voor het bestuderen van Virus Vergadering

In viruses with positive-sense RNA genomes pathogenic to humans, animals and plants, progeny encapsidation into mature and stable virions is a cardinal ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

Visualiseren van Dengue Virus via Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel<em&gt; In vitro</em&gt; Model voor het bestuderen van de interactie tussen menselijk volbloed en endotheel

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analyse van Myd88 gemedieerde cellulaire immuunrespons op West Nile Virus mutantstam Infectie

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofielen Isolatie en analyse van hun rol in de Lymphoma Cell Gevoeligheid voor therapeutische middelen te bepalen

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Demontage van influenza A-virus capsiden door gradiëntcentrifugatie

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

Een eenvoudige en efficiënte aanpak Mutant Vaccinia Virus vectoren Construct

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

In Vitro Methoden voor het vergelijken van Target Binding en CDC Inductie Tussen Therapeutische Antilichamen: Toepassingen in Biosimilarity Analysis

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

Een efficiënte en eenvoudige methode om de NK- en T cellijnen van patiënten met chronische actieve Epstein - Barr virusinfectie

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Een eenvoudige Stroom Cytometry gebaseerd Assay om te bepalen In Vitro antilichaam afhankelijk verbetering van Dengue Virus met behulp van de herstellende Serum Zika-Virus

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

Vergadering en zuivering van Prototype schuimend Virus Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...