Name: simple and robust in vivo and in vitro approach for studying virus assembly
Uploaded: 2012-03-01T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly at JoVE.com

Les auteurs tiennent à remercier plusieurs membres du laboratoire pour leurs précieuses suggestions dans le développement de agroinfiltration et dans des essais in vitro de montage. Ce travail a été financé par une subvention de l&#39;Université de Californie. Cette étude a été soutenue dans les régions par une subvention de la National Science Foundation (CBET-1144237).

1. Le matériel végétal <ol><li> Nicotiana benthamiana à être utilisés dans le test d&#39;encapsidation doivent être au stade de 4 feuilles (plantes semaine environ 3-4 ans). </li></ol> 2. La livraison et l&#39;expression de composants fonctionnels du génome viral à planter des cellules par agroinfiltration <ol><li> Jour 1: La souche d&#39;Agrobacterium (par exemple EH 105 ou GV 3101) hébergeant l&#39;ARN pCass-BMV 1, 2 et BMV ARN BMV ARN 3 1,2 so...

<ol>
	<li>Annamalai, P., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-independent+expression+of+genome+components+and+capsid+protein+of+brome+mosaic+virus+in+planta:+a+functional+role+for+viral+replicase+in+RNA+packaging.">Replication-independent expression of genome components and capsid protein of brome mosaic virus in planta: a functional role for viral replicase in RNA packaging.</a> Virology. 338, 96-111 (2005).</li><li>Annamalai, P., Rofail, F., Demason, D. A., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-coupled+packaging+mechanism+in+positive-strand+RNA+viruses:+synchronized+coexpression+of+functional+multigenome+RNA+components+of+an+animal+and+a+plant+virus+in+Nicotiana+benthamiana+cells+by+agroinfiltration.">Replication-coupled packaging mechanism in positive-strand RNA viruses: synchronized coexpression of functional multigenome RNA components of an animal and a plant virus in Nicotiana benthamiana cells by agroinfiltration.</a> J. Virol. 82, 1484-1495 (2008).</li><li>Annamalai, P., Rao, A. L., Foster, N., Johansen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plant Virology Protocols. 451, 251-264 (2008).</li><li>Lane, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bromoviruses.">The bromoviruses.</a> Adv. Virus Res. 19, 151-220 (1974).</li><li>Choi, Y. G., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+studies+on+bromovirus+capsid+protein.+VII.+Selective+packaging+on+BMV+RNA4+by+specific+N-terminal+arginine+residuals.">Molecular studies on bromovirus capsid protein. VII. Selective packaging on BMV RNA4 by specific N-terminal arginine residuals.</a> Virology. 275, 207-217 (2000).</li><li>Sambrrok, J., Russel, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , (2001).</li><li>Dreher, T. W., Rao, A. L., Hall, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+in+vivo+of+mutant+brome+mosaic+virus+RNAs+defective+in+aminoacylation.">Replication in vivo of mutant brome mosaic virus RNAs defective in aminoacylation.</a> J. Mol. Biol. 206, 425-438 (1989).</li><li>Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+nano-constructs+composed+of+genome-depleted+brome+mosaic+virus+doped+with+a+near+infrared+chromophore+for+potential+biomedical+applications.">Optical nano-constructs composed of genome-depleted brome mosaic virus doped with a near infrared chromophore for potential biomedical applications.</a> A.C.S. Nano. 5, 1243-1252 (2011).</li><li>Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viral+movement+protein+prevents+spread+of+the+gene+silencing+signal+in+Nicotiana+benthamiana.">A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana.</a> Cell. 103, 157-167 (2000).</li><li>Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Agrobacterium-mediated+transient+assays+of+gene+expression+in+lettuce,+tomato+and+Arabidopsis.">Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis.</a> Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).</li></ol>

Approche agroinfiltration présentée ici peut largement s&#39;appliquer à un large éventail de virus de plantes. Un des traits caractéristiques de cette approche est synchronisé livraison de multiples agroconstruct à la cellule, un même inconvénient majeur souvent associée à l&#39;inoculation mécanique couramment utilisés des virus des plantes. In vivo et dans les études d&#39;assemblage in vitro utilisant des virus de la mosaïque du brome comme un modèle peut être menée effic...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Le numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Les sels de sodium MES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2993 </td></tr><tr><td> Le vert d&#39;indocyanine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I2633 </td></tr><tr><td> Ultracentrifugeuse Beckman </td><td> Beckman Coulter </td><td> Modèle: L8-70M </td></tr><tr><td> Centricon-100 colonne </td><td> Millipore </td><td> YM-100 </td></tr><tr><td> Spectrophotomètre </td><td> Cary 50, Varian Inc </td><td> Numéro de la pièce 10068900 </td></tr><tr><td> Spectrofluorometer </td><td> Fluorolog 3, Jobin-Yvon. </td><td> Numéro de la pièce FL3-21 </td></tr></tbody></table>

simple and robust in vivo and in vitro approach for studying virus assembly

Dans les virus avec des génomes ARN de sens positif pathogènes pour les humains, les animaux et les plantes, d&#39;encapsidation descendance dans les virions matures et stable est une phase cardinal lors de l&#39;établissement de l&#39;infection chez un hôte donné. Par conséquent, l&#39;étude de l&#39;encapsidation déchiffre les informations concernant le savoir-faire de l&#39;assemblage du virus mécanisme de régulation pour former des virions infectieux. Cette information est essentielle dans la formulation de nouvelles méthodes de freiner la propagation du virus et de lutte contre les maladies. Encapsidation du virus peut être étudiée in vivo et in vitro. Encapsidation du génome in vivo est un processus hautement régulé sélective impliquant des interactions macromoléculaires et de compartimentation subcellulaire. Par conséquent, l&#39;étude menant à disséquer les événements englobant l&#39;encapsidation du virus in vivo permettrait connaissances de base pour comprendre comment les virus prolifèrent et à assembler. Récemment, dans l&#39;encapsidation in vitro a été exploitée pour la recherche dans le domaine de la recherche biomédicale imaGing et les applications thérapeutiques. Les virus des plantes non-enveloppés situer loin devant dans l&#39;aventure de l&#39;encapsidation in vitro dans de la matière chargée négativement étrangère. Virus de la mosaïque Brome (BMV), un agent pathogène non-enveloppé multicomposant virus à ARN pour les plantes, a été utilisé comme un système modèle pour l&#39;étude du génome dans l&#39;emballage vivo et in vitro. Pour les tests d&#39;encapsidation dans Nicotiana benthamiana, au moyen d&#39;Agrobacterium expression transitoire, reportez-vous comme agroinfiltration, est une technique efficace et robuste pour la livraison synchronisée et l&#39;expression de plusieurs composants à la même cellule. Dans cette approche, une suspension de cellules Agrobacterium tumefaciens portant binaires vecteurs plasmidiques portant des ADNc des ARNm desiredviral est infiltré dans la feuille withina espace intercellulaire en utilisant rien de plus sophistiqué qu&#39;une seringue de 1 ml à usage unique (sans aiguille). Ce processus aboutit à la cession de l&#39;insert d&#39;ADN dans des cellules végétales; l&#39;ADN-Tinsert reste transitoirement dans le noyau et est ensuite transcrit par la polymérase II d&#39;accueil, conduisant à l&#39;expression transitoire. La transcription d&#39;ARNm qui en résulte (plafonnés et polyadénylé) est ensuite exporté vers le cytoplasme pour la traduction. Après environ 24 à 48 heures d&#39;incubation, des sections de feuilles infiltrées peuvent être prélevés pour des analyses biochimiques microscopyor. Agroinfiltration permet un grand nombre (centaines ou milliers) de cellules à transfecter simultanément. À l&#39;encapsidation in vitro, de virions purifiés BMV sont dissociés en protéine de capside par dialyse contre un tampon de dissociation du chlorure de calcium contenant suivie de l&#39;élimination de l&#39;ARN et non dissociés virions par centrifugation. Génome sous-unités appauvries protéine de capside sont ensuite remontés avec souhaités composants du génome viral ou non-viraux tels que les composants indocyanine.

Watch this Scientific Journal Video about Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly at JoVE.com

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

Un moyen simple, efficace et robuste pour synchroniser la livraison de plusieurs composants viraux dans les cellules végétales par le biais<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Médiée par l&#39;expression transitoire est décrit. Cette approche est susceptible d&#39;étude de la réplication, l&#39;encapsidation suivie par<em&gt; In vitro</em&gt; Le remontage de la non-virales dans le génome des composants optiques appauvri fantômes virales appropriés pour des applications biomédicales.

Simple et robuste In vivo Et In vitro Démarche pour l&#39;étude de l&#39;assemblage du virus

In viruses with positive-sense RNA genomes pathogenic to humans, animals and plants, progeny encapsidation into mature and stable virions is a cardinal ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

Visualisation virus de la dengue grâce à Alexa Fluor Étiquetage

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Recherche

Immunologie et infection

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle pour l&#39;étude des interactions entre les droits du sang total et de l&#39;endothélium

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Analyse in vitro de la réponse immunitaire cellulaire Myd88 médiation au virus du Nil occidental souche mutante Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophiles Isolement et analyse pour déterminer leur rôle dans le lymphome cellulaire Sensibilité aux agents thérapeutiques

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro désassemblage du virus grippal A capsides par Centrifugation Gradient

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

Une approche simple et efficace de construire Mutant Vaccinia vecteurs de virus

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

Méthodes in vitro pour la comparaison de liaison cible et CDC induction entre les anticorps thérapeutiques: Applications dans l&#39; analyse biosimilarité

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

Une méthode Simple et efficace pour établir les NK et les lymphocytes T lignes provenant de Patients avec une Infection chronique Active Virus Epstein - Barr

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Un Simple écoulement Cytometry Based Assay pour déterminer In Vitro anticorps dépendant amélioration du Virus de la Dengue à l’aide de sérum de Convalescent Virus Zika

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

L’Assemblée et la Purification du Prototype spumavirus Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...