Name: simple and robust in vivo and in vitro approach for studying virus assembly
Uploaded: 2012-03-01T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke flere medlemmer av lab for sine verdifulle innspill i utviklingen av agroinfiltration og in vitro montering analyser. Dette arbeidet ble finansiert av et stipend fra University of California. Denne studien ble støttet i deler av et stipend fra National Science Foundation (CBET-1144237).

1. Plantemateriale <ol><li> Nicotiana benthamiana planter som skal brukes i encapsidation analysen bør være på 4 blader stadiet (ca 3-4 ukers gamle planter). </li></ol> 2. Levering og uttrykk av funksjonelle virusgenomet komponenter til planteceller ved agroinfiltration <ol><li> Dag 1: Agrobacterium stamme (eg. EH 105 eller GV 3101) harboring den pCass-BMV en RNA, BMV RNA 2 og BMV RNA 3 1,2 dyrkes på LB agar plater supplert med 50 mg / ml kanamycin (ve...

<ol>
	<li>Annamalai, P., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-independent+expression+of+genome+components+and+capsid+protein+of+brome+mosaic+virus+in+planta:+a+functional+role+for+viral+replicase+in+RNA+packaging.">Replication-independent expression of genome components and capsid protein of brome mosaic virus in planta: a functional role for viral replicase in RNA packaging.</a> Virology. 338, 96-111 (2005).</li><li>Annamalai, P., Rofail, F., Demason, D. A., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-coupled+packaging+mechanism+in+positive-strand+RNA+viruses:+synchronized+coexpression+of+functional+multigenome+RNA+components+of+an+animal+and+a+plant+virus+in+Nicotiana+benthamiana+cells+by+agroinfiltration.">Replication-coupled packaging mechanism in positive-strand RNA viruses: synchronized coexpression of functional multigenome RNA components of an animal and a plant virus in Nicotiana benthamiana cells by agroinfiltration.</a> J. Virol. 82, 1484-1495 (2008).</li><li>Annamalai, P., Rao, A. L., Foster, N., Johansen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plant Virology Protocols. 451, 251-264 (2008).</li><li>Lane, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bromoviruses.">The bromoviruses.</a> Adv. Virus Res. 19, 151-220 (1974).</li><li>Choi, Y. G., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+studies+on+bromovirus+capsid+protein.+VII.+Selective+packaging+on+BMV+RNA4+by+specific+N-terminal+arginine+residuals.">Molecular studies on bromovirus capsid protein. VII. Selective packaging on BMV RNA4 by specific N-terminal arginine residuals.</a> Virology. 275, 207-217 (2000).</li><li>Sambrrok, J., Russel, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , (2001).</li><li>Dreher, T. W., Rao, A. L., Hall, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+in+vivo+of+mutant+brome+mosaic+virus+RNAs+defective+in+aminoacylation.">Replication in vivo of mutant brome mosaic virus RNAs defective in aminoacylation.</a> J. Mol. Biol. 206, 425-438 (1989).</li><li>Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+nano-constructs+composed+of+genome-depleted+brome+mosaic+virus+doped+with+a+near+infrared+chromophore+for+potential+biomedical+applications.">Optical nano-constructs composed of genome-depleted brome mosaic virus doped with a near infrared chromophore for potential biomedical applications.</a> A.C.S. Nano. 5, 1243-1252 (2011).</li><li>Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viral+movement+protein+prevents+spread+of+the+gene+silencing+signal+in+Nicotiana+benthamiana.">A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana.</a> Cell. 103, 157-167 (2000).</li><li>Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Agrobacterium-mediated+transient+assays+of+gene+expression+in+lettuce,+tomato+and+Arabidopsis.">Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis.</a> Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).</li></ol>

Agroinfiltration tilnærming som presenteres her kan mye være knyttet til et bredt spekter av plante virus. Et kjennetegn trekk ved denne tilnærmingen er synkronisert levering av flere agroconstruct til samme celle-en stor ulempe vanligvis forbindes med rutinemessig brukes mekanisk inokulering av plante virus. In vivo og in vitro montering studier med brome mosaic virus som modell kan gjennomføres effektivt ved Følgende noen tips. (i) for vellykket infiltrasjon av N. benthamiana forlater i...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagensen </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> MES Natriumsalter </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2993 </td></tr><tr><td> Indocyanine grønn </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I2633 </td></tr><tr><td> Beckman Ultrasentrifuger </td><td> Beckman Coulter </td><td> Modell: L8-70m </td></tr><tr><td> Centricon-100 kolonne </td><td> Millipore </td><td> YM-100 </td></tr><tr><td> Spektrofotometer </td><td> 50 Cary, Varian Inc. </td><td> Delenummer 10068900 </td></tr><tr><td> Spektrofluorometer </td><td> 3 Fluorolog, Jobin-Yvon. </td><td> Delenummer FL3-21 </td></tr></tbody></table>

simple and robust in vivo and in vitro approach for studying virus assembly

I virus med positiv-sense RNA genomet patogene for mennesker, dyr og planter, avkom encapsidation til modne og stabile virioner er en kardinal fase under etablering av infeksjon i en gitt host. Følgelig deciphers studie av encapsidation informasjon om know-how av mekanismen regulere viruset forsamlingen til å danne smittsomme virioner. Slik informasjon er viktig i utformingen av nye metoder for å dempe viruset spres og sykdomskontroll. Virus encapsidation kan studeres in vivo og in vitro. Genome encapsidation in vivo er en svært regulert selektiv prosess som involverer makromolekylær interaksjoner og subcellulære compartmentalization. Derfor studerer fører til dissekere hendelser som omfatter virus encapsidation in vivo ville gi grunnleggende kunnskap for å forstå hvordan virus sprer og montere. Nylig in vitro encapsidation har vært utnyttet til forskning på området i biomedisinsk imaGing og terapeutiske anvendelser. Ikke-kappekledde plante virus stå langt fremme i venture av in vitro encapsidation av negativt ladet utenlandsk materiale. Brome mosaic virus (BMV), en ikke-kappekledde multikomponente RNA virus patogene for planter, har vært brukt som en modell for å studere genomet emballasje in vivo og in vitro. For encapsidation analyser i Nicotiana benthamiana planter, Agrobacterium-mediert forbigående uttrykk, kaller agroinfiltration, er en effektiv og robust teknikk for den synkroniserte levering og uttrykk av flere komponenter til samme celle. I denne tilnærmingen, er en suspensjon av Agrobacterium tumefaciens celler som frakter binære Plasmid vektorer bærer cDNAs av desiredviral mRNAs infiltrerte intercellular verdensrommet withina blad med noe mer sofistikert enn en 1 ml engangssprøyte (uten nål). Denne prosessen resulterer i overføring av DNA setter inn planteceller, T-DNASett forblir midlertidig i kjernen og blir deretter transkribert av verten polymerase II, som fører til forbigående uttrykk. Den resulterende mRNA transkripsjon (avkortet og polyadenylated) blir deretter eksportert til cytoplasma for oversettelse. Etter ca 24 til 48 timer inkubasjon, kan deler av infiltrert blader tas prøver for microscopyor biokjemiske analyser. Agroinfiltration tillater store tall (hundrevis til tusenvis) av celler som skal transfekterte samtidig. For in vitro encapsidation, rensede virioner av BMV er dissosiert til kapsid protein ved dialyzing mot dissosiasjon buffer som inneholder kalsiumklorid etterfulgt av fjerning av RNA og un-dissosiert virioner ved sentrifugering. Genomet utarmet kapsid protein subenheter er montert igjen med ønskede virusgenomet komponenter eller ikke-virale komponenter som indocyanine fargestoff.

Watch this Scientific Journal Video about Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly at JoVE.com

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

En enkel, effektiv og robust måte å synkronisere levering av flere virale komponenter til planteceller via<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Mediert forbigående uttrykk er beskrevet. Denne tilnærmingen er mottagelig for å studere replikering, etterfulgt encapsidation av<em&gt; In vitro</em&gt; Remontering av ikke-virale komponenter i genomet utarmet optiske virale spøkelser egnet for biomedisinske applikasjoner.

Enkel og robust In vivo Og In vitro Approach for å studere Virus Assembly

In viruses with positive-sense RNA genomes pathogenic to humans, animals and plants, progeny encapsidation into mature and stable virions is a cardinal ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel<em&gt; In vitro</em&gt; Modell for å studere samspillet mellom humant fullblod og endotelet

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analyse av MyD88-mediert cellulær immunrespons til West Nile Virus Mutant Strain Infeksjon

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Nøytrofile Isolering og analyse for å fastslå deres rolle i lymfom Cell Følsomhet for Terapeutiske midler

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Demontering av influensa A virus kapsider ved gradientsentrifugering

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

En enkel og effektiv tilnærming til Konstruer Mutant vacciniavirus vektorer

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

In vitro- metoder for sammenligning av målbinding og CDC-induksjon mellom terapeutiske antistoffer: applikasjoner i biosimilaritetsanalyse

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

En effektiv og enkel metode for å etablere NK og T cellelinjer fra pasienter med kronisk aktiv Epstein - Barr virusinfeksjon

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

En enkel flowcytometri basert analyse for å fastslå In Vitro antistoff avhengige forbedring av Dengue Virus benytter Zika Virus rekonvalesent Serum

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

Montering og rensing av Prototype skummende Virus Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...