Name: simple and robust in vivo and in vitro approach for studying virus assembly
Uploaded: 2012-03-01T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly at JoVE.com

Os autores gostariam de agradecer a vários membros do laboratório para as suas sugestões valiosas para o desenvolvimento de agroinfiltration e em ensaios in vitro de montagem. Este trabalho foi financiado por uma bolsa da Universidade da Califórnia. Este estudo foi financiado em partes por uma concessão do National Science Foundation (CBET-1144237).

1. O material vegetal <ol><li> Plantas de Nicotiana benthamiana a serem utilizados no ensaio de encapsidação deve estar na fase 4 folhas (plantas semana aproximadamente 3-4 de idade). </li></ol> 2. Entrega e expressão de componentes funcionais do genoma viral para plantar células por agroinfiltration <ol><li> Dia 1: A estirpe de Agrobacterium (por exemplo, EH 105 ou GV 3101) abrigando o RNA pCass-BMV 1, BMV RNA 2 e 3 BMV RNA 1,2 são cultivadas em plac...

<ol>
	<li>Annamalai, P., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-independent+expression+of+genome+components+and+capsid+protein+of+brome+mosaic+virus+in+planta:+a+functional+role+for+viral+replicase+in+RNA+packaging.">Replication-independent expression of genome components and capsid protein of brome mosaic virus in planta: a functional role for viral replicase in RNA packaging.</a> Virology. 338, 96-111 (2005).</li><li>Annamalai, P., Rofail, F., Demason, D. A., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-coupled+packaging+mechanism+in+positive-strand+RNA+viruses:+synchronized+coexpression+of+functional+multigenome+RNA+components+of+an+animal+and+a+plant+virus+in+Nicotiana+benthamiana+cells+by+agroinfiltration.">Replication-coupled packaging mechanism in positive-strand RNA viruses: synchronized coexpression of functional multigenome RNA components of an animal and a plant virus in Nicotiana benthamiana cells by agroinfiltration.</a> J. Virol. 82, 1484-1495 (2008).</li><li>Annamalai, P., Rao, A. L., Foster, N., Johansen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plant Virology Protocols. 451, 251-264 (2008).</li><li>Lane, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bromoviruses.">The bromoviruses.</a> Adv. Virus Res. 19, 151-220 (1974).</li><li>Choi, Y. G., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+studies+on+bromovirus+capsid+protein.+VII.+Selective+packaging+on+BMV+RNA4+by+specific+N-terminal+arginine+residuals.">Molecular studies on bromovirus capsid protein. VII. Selective packaging on BMV RNA4 by specific N-terminal arginine residuals.</a> Virology. 275, 207-217 (2000).</li><li>Sambrrok, J., Russel, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , (2001).</li><li>Dreher, T. W., Rao, A. L., Hall, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+in+vivo+of+mutant+brome+mosaic+virus+RNAs+defective+in+aminoacylation.">Replication in vivo of mutant brome mosaic virus RNAs defective in aminoacylation.</a> J. Mol. Biol. 206, 425-438 (1989).</li><li>Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+nano-constructs+composed+of+genome-depleted+brome+mosaic+virus+doped+with+a+near+infrared+chromophore+for+potential+biomedical+applications.">Optical nano-constructs composed of genome-depleted brome mosaic virus doped with a near infrared chromophore for potential biomedical applications.</a> A.C.S. Nano. 5, 1243-1252 (2011).</li><li>Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viral+movement+protein+prevents+spread+of+the+gene+silencing+signal+in+Nicotiana+benthamiana.">A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana.</a> Cell. 103, 157-167 (2000).</li><li>Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Agrobacterium-mediated+transient+assays+of+gene+expression+in+lettuce,+tomato+and+Arabidopsis.">Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis.</a> Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).</li></ol>

Abordagem Agroinfiltration aqui apresentadas podem ser amplamente aplicável a uma ampla gama de vírus de plantas. Uma característica marca desta abordagem é sincronizado entrega de agroconstruct múltipla para a célula-a mesma desvantagem importante geralmente associado com rotineiramente utilizado inoculação mecânica de vírus de plantas. In vivo e in vitro de montagem, utilizando brome vírus do mosaico como um modelo pode ser conduzida de forma eficiente pela a seguir algumas dicas. (i) para...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td></tr><tr><td> Sódio sais MES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2993 </td></tr><tr><td> Indocianina verde </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I2633 </td></tr><tr><td> Ultracentrífuga Beckman </td><td> Beckman Coulter </td><td> Modelo: L8-70M </td></tr><tr><td> Centricon-100 coluna </td><td> Millipore </td><td> YM-100 </td></tr><tr><td> Espectrofotômetro </td><td> Cary 50, Varian Inc. </td><td> Número da peça 10068900 </td></tr><tr><td> Espectrofluorímetro </td><td> Fluorolog 3, Jobin-Yvon. </td><td> Número da peça FL3-21 </td></tr></tbody></table>

simple and robust in vivo and in vitro approach for studying virus assembly

Em vírus com sentido positivo patogênico genomas RNA de seres humanos, animais e plantas, de encapsidação progênie em viriões maduros e estáveis ​​é uma fase cardeal durante o estabelecimento da infecção em um determinado host. Consequentemente, o estudo de encapsidação decifra as informações sobre o know-how do mecanismo de regulação montagem do vírus para formar virions infecciosos. Essa informação é vital na formulação de novos métodos de contenção propagação do vírus e controle da doença. Encapsidação vírus pode ser estudada in vivo e in vitro. Encapsidação Genoma in vivo é um processo altamente regulado seletiva envolvendo interações macromoleculares e compartimentalização subcelular. Portanto, estudar levando a dissecar eventos abrangendo encapsidação vírus in vivo seria fornecer conhecimentos básicos para compreender como os vírus se proliferam e montar. Recentemente, em encapsidação vitro tem sido explorada para a pesquisa na área de biomédica imaging e aplicações terapêuticas. Vírus não-envelopados plantas estão muito à frente no empreendimento de encapsidação em vitro da matéria carregada negativamente estrangeira. Brome vírus do mosaico (BMV), um não encapsulado multicomponente patogenicidade do vírus de RNA para plantas, tem sido utilizado como um sistema modelo para estudar embalagem genoma in vivo e in vitro. Para os ensaios de encapsidação em plantas de Nicotiana benthamiana, mediada por Agrobacterium de expressão transiente, se referem como agroinfiltration, é uma técnica eficiente e fiável para a entrega sincronizado e expressão de componentes múltiplos para a mesma célula. Nesta abordagem, uma suspensão de células de Agrobacterium tumefaciens que transportam binários vectores plasmídicos transportando cDNAs de mRNAs desiredviral é infiltrado no espaço intercelular folha withina usando nada mais sofisticado que uma seringa de 1 ml descartável (sem agulha). Este processo resulta na transferência de inserção de ADN em células vegetais; o T-DNAinserto permanece transientemente no núcleo e, em seguida, é transcrito pelo hospedeiro polimerase II, que conduz à expressão transiente. A transcrição do mRNA resultante (nivelado e poliadenilado) é então exportado para o citoplasma para a tradução. Após aproximadamente 24 a 48 horas de incubação, as secções de folhas infiltradas pode ser amostrada para microscopyor análises bioquímicas. Agroinfiltration permite um grande número (centenas a milhares) de células a serem transfectadas simultaneamente. Para na encapsidação vitro, partículas virais purificadas de BMV são dissociados em proteína da cápside por diálise contra a dissociação de cloreto de cálcio tampão contendo seguido por remoção de RNA e un-dissociados viriões por centrifugação. Genoma empobrecido subunidades da proteína da cápside são reagrupados com desejados componentes do genoma viral ou não virais, tais como componentes indocianina corante.

Watch this Scientific Journal Video about Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly at JoVE.com

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

Uma maneira simples, eficiente e robusta para sincronizar a entrega de múltiplos componentes virais para as células vegetais através<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Mediada expressão transiente é descrito. Esta abordagem é favorável para estudar a replicação, encapsidação seguido por<em&gt; In vitro</em&gt; Remontagem de componentes não-virais do genoma empobrecido ópticos fantasmas virais adequados para aplicações biomédicas.

Simples e robusto In vivo E In vitro Abordagem para o Estudo Assembléia Virus

In viruses with positive-sense RNA genomes pathogenic to humans, animals and plants, progeny encapsidation into mature and stable virions is a cardinal ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

Visualizando Vírus da Dengue por meio Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Imunologia e Infecção

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudar as interações entre a Whole Humano Sangue e endotélio

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Análise do mediada por Myd88 Cellular resposta imune a vírus do Nilo Ocidental Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Isolamento de neutrófilos e análise para determinar seu papel na linfoma sensibilidade das células a agentes terapêuticos

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro A desmontagem do vírus influenza A capsï¿½eos por centrifugação em gradiente

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

Uma abordagem simples e eficiente para construir vectores de vírus mutante Vaccinia

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

Os métodos in vitro para Comparando meta vinculativa e CDC indução Entre anticorpos terapêuticos: Aplicações em Análise Biosimilarity

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

Um método simples e eficiente para estabelecer linhas de células T de pacientes com infecção crônica ativa vírus Epstein - Barr e NK

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

A citometria de fluxo simples com base em ensaio para determinar In Vitro anticorpo dependente do realce do vírus da Dengue, usando soro convalescente vírus Zika

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

Montagem e purificação do protótipo vírus espumoso Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...