Name: simple and robust in vivo and in vitro approach for studying virus assembly
Uploaded: 2012-03-01T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly at JoVE.com

Författarna vill tacka flera medlemmar av labbet för deras värdefulla förslag i utvecklingen av agroinfiltration och in vitro montering analyser. Detta arbete har finansierats genom ett bidrag från University of California. Denna studie stöddes i delar av ett bidrag från National Science Foundation (CBET-1.144.237).

1. Växtmaterial <ol><li> Nicotiana benthamiana växter ska användas i inkapsling analysen bör vara 4 blad stadium (ca 3-4 veckor gamla växter). </li></ol> 2. Leverans och expression av funktionella virala genomet komponenter till växtceller genom agroinfiltration <ol><li> Dag 1: Agrobacterium-stam (t ex EH 105 eller GV 3101) härbärgerande pCass-BMV-RNA 1, BMV-RNA 2 och BMV-RNA 3 1,2 odlas på LB-agarplattor kompletterade med 50 mg / ml av kanamycin ...

<ol>
	<li>Annamalai, P., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-independent+expression+of+genome+components+and+capsid+protein+of+brome+mosaic+virus+in+planta:+a+functional+role+for+viral+replicase+in+RNA+packaging.">Replication-independent expression of genome components and capsid protein of brome mosaic virus in planta: a functional role for viral replicase in RNA packaging.</a> Virology. 338, 96-111 (2005).</li><li>Annamalai, P., Rofail, F., Demason, D. A., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-coupled+packaging+mechanism+in+positive-strand+RNA+viruses:+synchronized+coexpression+of+functional+multigenome+RNA+components+of+an+animal+and+a+plant+virus+in+Nicotiana+benthamiana+cells+by+agroinfiltration.">Replication-coupled packaging mechanism in positive-strand RNA viruses: synchronized coexpression of functional multigenome RNA components of an animal and a plant virus in Nicotiana benthamiana cells by agroinfiltration.</a> J. Virol. 82, 1484-1495 (2008).</li><li>Annamalai, P., Rao, A. L., Foster, N., Johansen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plant Virology Protocols. 451, 251-264 (2008).</li><li>Lane, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bromoviruses.">The bromoviruses.</a> Adv. Virus Res. 19, 151-220 (1974).</li><li>Choi, Y. G., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+studies+on+bromovirus+capsid+protein.+VII.+Selective+packaging+on+BMV+RNA4+by+specific+N-terminal+arginine+residuals.">Molecular studies on bromovirus capsid protein. VII. Selective packaging on BMV RNA4 by specific N-terminal arginine residuals.</a> Virology. 275, 207-217 (2000).</li><li>Sambrrok, J., Russel, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , (2001).</li><li>Dreher, T. W., Rao, A. L., Hall, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+in+vivo+of+mutant+brome+mosaic+virus+RNAs+defective+in+aminoacylation.">Replication in vivo of mutant brome mosaic virus RNAs defective in aminoacylation.</a> J. Mol. Biol. 206, 425-438 (1989).</li><li>Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+nano-constructs+composed+of+genome-depleted+brome+mosaic+virus+doped+with+a+near+infrared+chromophore+for+potential+biomedical+applications.">Optical nano-constructs composed of genome-depleted brome mosaic virus doped with a near infrared chromophore for potential biomedical applications.</a> A.C.S. Nano. 5, 1243-1252 (2011).</li><li>Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viral+movement+protein+prevents+spread+of+the+gene+silencing+signal+in+Nicotiana+benthamiana.">A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana.</a> Cell. 103, 157-167 (2000).</li><li>Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Agrobacterium-mediated+transient+assays+of+gene+expression+in+lettuce,+tomato+and+Arabidopsis.">Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis.</a> Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).</li></ol>

Agroinfiltration tillvägagångssätt presenteras här kan allmänt tillämpas på ett brett spektrum av växtvirus. En kännetecknande egenskap hos detta tillvägagångssätt är synkroniserad avgivning av multipla agroconstruct till samma cell-en stor nackdel förknippad med rutinmässigt används mekanisk inokulering av växtvirus. In vivo och in vitro montering studier med användning av Brome mosaikvirus som en modell kan utföras effektivt genom Följande några tips. (i) för framgångsrik infil...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet på reagens </td><td> Företaget </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> MES Natriumsalter </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2993 </td></tr><tr><td> Indocyaningrönt </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I2633 </td></tr><tr><td> Beckman ultracentrifug </td><td> Beckman Coulter </td><td> Modell: L8-70M </td></tr><tr><td> Centricon-100-kolonn </td><td> Millipore </td><td> YM-100 </td></tr><tr><td> Spektrofotometer </td><td> Cary 50, Varian Inc. </td><td> Artikelnummer 10068900 </td></tr><tr><td> Spektrofluorometer </td><td> Fluorolog 3, Jobin-Yvon. </td><td> Artikelnummer FL3-21 </td></tr></tbody></table>

simple and robust in vivo and in vitro approach for studying virus assembly

I virus med positiv RNA-genom patogena för människor, djur och växter, avkomma inkapsling i mogna och stabila virioner är en kardinal fas under etablering av infektion i en given värd. Följaktligen dechiffrerar studie av inkapsling uppgifter om know-how av mekanismen reglera viruset församlingen att bilda infektiösa virioner. Sådan information är viktig att formulera nya metoder för att stävja virus sprids och sjukdomar. Virus inkapsling kan studeras in vivo och in vitro. Genome inkapsling in vivo är en starkt reglerad selektiv process där makromolekylära interaktioner och subcellulära uppdelningsåtgärder. Därför studerar vilket leder till dissekera händelser omfattar virus inkapsling in vivo skulle ge grundläggande kunskaper för att förstå hur virus förökar och montera. Nyligen in vitro inkapsling har utnyttjats för forskning inom området biomedicinsk imaGing och terapeutiska tillämpningar. Icke höljeförsedda växtvirus står långt fram i satsningen av in vitro inkapsling av den negativt laddade främmande material. Brome mosaikvirus (BMV), ett icke höljeförsedda multikomponent RNA-virus som är patogena för växter, har använts som ett modellsystem för att studera genomet förpackning in vivo och in vitro. För inkapsling analyser i Nicotiana benthamiana växter, Agrobacterium-medierad övergående uttryck, refererar till som agroinfiltration är en effektiv och robust teknik för den synkroniserade leverans och expression av flera komponenter till samma cell. I detta tillvägagångssätt är en suspension av Agrobacterium tumefaciens celler som bär binära plasmidvektorer som bär cDNA för desiredviral mRNA infiltreras i det intercellulära utrymmet withina blad med inget mer sofistikerat än en 1 ml engångsspruta (utan nål). Denna process resulterar i överföringen av DNA-insättningen i växtceller; den T-DNA-insatsen förblir transient i kärnan och därefter transkriberas av värden polymeras II, vilket leder till övergående uttryck. Den resulterande mRNA-transkript (tak och polyadenylerat) sedan exporteras till cytoplasman för översättning. Efter ungefär 24 till 48 timmars inkubation, kan sektioner av infiltrerade blad tas prov för microscopyor biokemiska analyser. Agroinfiltration medger ett stort antal (hundratals till tusentals) celler som skall transfekteras samtidigt. För in vitro inkapsidering, renade virioner av BMV dissocieras in kapsidprotein genom dialys mot dissociation buffert innehållande kalciumklorid, följt av avlägsnande av RNA och icke-differentierade virioner genom centrifugering. Genomet utarmade kapsidproteinet subenheter sedan ihop med önskade virala genomet komponenter eller icke-virala komponenter, såsom indocyanin färgämne.

Watch this Scientific Journal Video about Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly at JoVE.com

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

En enkel, effektiv och robust sätt att synkronisera leveransen av multipla virala komponenter till växtceller genom<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Medierad transient uttryck att beskrivas. Detta tillvägagångssätt är mottaglig för att studera replikering, följt inkapsling av<em&gt; In vitro</em&gt; Återmontering av icke-virala komponenter i genomet utarmat optiska virala spöken som är lämpliga för biomedicinska tillämpningar.

Enkel och robust In vivo Och In vitro Tillvägagångssätt för att studera Virus Assembly

In viruses with positive-sense RNA genomes pathogenic to humans, animals and plants, progeny encapsidation into mature and stable virions is a cardinal ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

Visualisering Dengue genom Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel<em&gt; In vitro</em&gt; Modell för att studera interaktioner mellan humant helblod och endotelet

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In vitro Analys av MyD88-medierad cellulärt immunsvar till West Nile-virus mutant stam Infektion

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering och analys för att fastställa deras roll i lymfom Cell Känslighet för terapeutiska medel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

I vitro Demontering av influensa A-virus-kapsider genom gradientcentrifugering

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

En enkel och effektiv strategi för att konstruera Mutant vacciniavirus vektorer

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

In vitro- metoder för att jämföra målbindning och CDC-induktion mellan terapeutiska antikroppar: applikationer i biosimilaritetsanalys

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

En effektiv och enkel metod för att fastställa NK och T cellinjer från patienter med kronisk aktiv Epstein - Barr virusinfektion

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

En enkel flödescytometri baserat test för att bestämma In Vitro antikropp beroende förbättring av denguefeber Virus använder Zika Virus konvalescent Serum

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

Montering och rening av prototyp skummande Virus Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...