Name: locked nucleic acid flow cytometry-fluorescence in situ hybridization (lna flow-fish): a method for bacterial small rna detection
Uploaded: 2012-01-10T13:00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Office of Naval Research via US Naval Research Laboratory core midler.

1. LNA prober og eksperimenterende design <ol><li> Design LNA prober, der er den omvendte supplement til din transskriberede Srna / mRNA eller få dem specialdesignede på <a href="http://www.exiqon.com">www.exiqon.com</a> . Hvis du bruger den brugerdefinerede design mulighed, vil du kender sekvensen, men ikke LNA saette mønster. Tilføjelsen af hver enkelt LNA rester i et DNA-eller RNA oligonukleotid resulterer i en stigning i T m mellem to og 10 ° C i LNA-RNA hybridisering duplex 14. Ideelt set bør designet LNA prober være mellem 20-25 nukleotider i længde (længere sonder er vanskeligere at syntetisere) og har en T m på mellem 85-90 ° C for RNA hybridisering. </li><li> Efter at designe den rækkefølge, bruge BLAST <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> eller sammenligne sonden sekvens til din lokale database for at sikre, at sonden er unik for din Srna / mRNA af interesse. </li><li>Ved bestilling af LNA sonde, tilføje en biotin-TEG ændring til 5 &#39;enden af ​​LNA oligonucleotid. Den biotinylation er nødvendig for post-hybridisering farvning med en streptavidin-farvestof konjugat. Det er muligt at tilføje denne ændring til 3 &#39;ende, hvis nødvendigt, men tilføjelsen til 5&#39; enden er billigere og bør resultere i højere udbytte. </li><li> Tre negative kontroller bør indgå i metoden: (i) et &quot;nej LNA&quot; kontrol, hvor en LNA sonden er ikke tilføjet under hybridisering trin, (ii) et &quot;nej farvestof &#39;kontrol, hvor LNA sonden er hybridiseret til Målet Srna men hybridisering begivenhed er ikke opdages på grund af fraværet af fluorescerende pletten, og (iii) en »ikke-udtrykte Srna / mRNA&quot; kontrol, der bruger et LNA-sonde, der retter sig mod en ikke-eksisterende eller ikke-udtrykte Srna for til at overvåge ikke-specifik hybridisering. </li><li> De specifikke LNA sonden her er et supplement til Srna CsrB og har sekvensen 5&#39;-biotin-TEG-gTccAttTccCgtCctTagCagC-3 &#39;(LNA monomerer istore bogstaver). </li><li> Efter modtagelsen af ​​frysetørrede LNA, resuspender med nuklease-frit vand til 50 mikrogram / ml og opbevar på 10-20 μL alikvoter ved -20 ° C. </li></ol> Løsninger <ul><li> 8% paraformaldehye (PFA), 10% eddikesyre i PBS: Bland 1 ml 32% PFA, 400 μL eddikesyre, 400 μL 10X PBS, pH = 7,4, og 2,2 mL nuklease-frit vand. For frosne delprøver, fastfrysning engangsbrug alikvoter ved -20 ° C uden eddikesyre. </li><li> 60% dextransulfat løsning: Tilføj 6,0 g dextran sulfat til en 50 ml konisk rør og tilsæt vand til et endeligt volumen på 10 ml. Varm blandingen til 65 ° C i et vandbad, indtil dextransulfat er opløst (kan tage 1-2 timer). Yderligere vand kan være nødvendigt at blive tilføjet i hele solubilization processen til at opretholde en 10 ml volumen. Delprøve på 60% dextransulfat løsning og opbevares ved -20 ° C indtil brug. </li></ul> 2. Fiksering <ol><li> Harvest 1x10 8 celler af bioluminiscerende <em&gt; Vibrio campbellii eller din bakterier af interesse og overføre dem til et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Denne mængde af celler giver nok udgangsmateriale for fire flow-FISH prøver (én specifik LNA probe prøve og tre negative kontroller). Yderligere 1,5 ml mikrocentrifugerør aliquoter skal indsamles, hvis andre Srna / mRNA arter skal testes. </li><li> Pelleter bakterieceller ved centrifugering ved 2300 xgi fem minutter. Supernatanten fjernes ved pipettering og cellerne i 400 μL 1X PBS. </li><li> Til denne blanding, 400 μL af en 8% paraformaldehye (PFA), og 10% eddikesyre i 1X fosfat tilføje bufferet saltvand (1X PBS) opløsning, bland godt, og inkuber i 10 minutter ved 25 ° C blandes en gang efter fem minutter. Alle inkubationer, medmindre andet er anført, er udført i et opvarmet rør holder. Den PFA Opløsningen skal være forberedt friske eller bruges fra frosne portioner efter tilsætning af eddikesyre. Paraformaldehyd er en crosslinking fiksativ, der helps at bevare cellemorfologi og fastholde intracellulære RNA. </li><li> Pelleter celler fra denne blanding ved centrifugering ved 4500 xg i to minutter og fjern supernatanten ved pipettering. Alle fremtidige skridt, som kræver centrifugering skal bruge de samme indstillinger (7K, 2 min). Det er vigtigt at bemærke, at der efter centrifugering supernatanter skal fjernes ved pipettering og ikke dekantering. </li><li> Vask cellerne to gange med 400 μL 1X PBS og resuspender endelige cellepelleten i 400 μL 1X PBS. Cellerne er nu fast og kan opbevares ved 4 ° C i 400 μL 1x PBS i op til syv dage. </li></ol> 3. Diethyl pyrocarbonate behandling <ol><li> Forbered 400 μL af en 0,1% opløsning af diethyl pyrocarbonate (DEPC) i 1X PBS (400 μL af denne løsning er nødvendig for hver prøve, der skal afprøves, så skalaen i overensstemmelse hermed). Den DEPC Opløsningen skal være forberedt frisk fra en DEPC lager. DEPC behandlingen inaktiverer RNases ved carbethoxylation og nedsætterBaggrunden signal. </li><li> Tilsæt 400 μL af 0,1% DEPC løsning til hver enkelt fast bakterielle celle prøve og bland godt ved pipettering. Inkuber denne blanding ved 25 ° C i 12 minutter. Vask cellerne to gange med 400 μL 1X PBS, pellet cellerne (7K, 2 min) og fjern supernatant. </li></ol> 4. Permeabilization <ol><li> Tilsæt 1,0 mg lysozym til 1 mL Tris-EDTA-buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) til en 1,0 mg / ml opløsning. Denne løsning skal forberedes frisk. Tilsæt 800 μL af 1 mg / mL lysozym løsning på cellerne, blandes omhyggeligt ved pipettering og inkuberes ved 25 ° C i 30 minutter med lejlighedsvise blanding. Pelleter celler (7K, 2 min) og fjern supernatant. Lysozym virker som en permeabilization reagens ved hydrolyse af peptidoglycan stede i bakteriernes cellevægge. </li><li> Forbered en 3,0 mikrogram / ml opløsning af proteinase K i TE buffer. Denne løsning skal fremstilles frisk fra en 20 mg / ml proteinase K bestand, der opbevares ved -20 ° C.Proteinase K er en serin protease, der fordøjer en bred vifte af proteiner og bidrager til tilgængeligheden af ​​de sonder og reagenser til RNA. </li><li> Tilsæt 800 μL af 3,0 mikrogram / ml proteinase K løsning cellepelleten og bland omhyggeligt ved pipettering. Inkuber ved 25 ° C i 15 minutter med hvirvelblanding halvvejs gennem inkubation. </li><li> Pelleter celler (7K, 2 min), fjern supernatanten og vaske celler gang med 400 μL 1X PBS. Efter at have fjernet vask supernatanten, opblande cellerne i 400 μL 1X PBS og tilsættes 100 μL af ophvirvling i fire nye 1,5 ml mikrocentrifugerør. Pelleter celler (7K, 2 min) og fjern supernatant. </li></ol> 5. Hybridisering <ol><li> Fremstilling af 100 μL af hybridisering buffer (HB) for hver prøve. HB består af 50% formamid volumen, 10% dextransulfat efter masse (tilføj 16,7 μL af 60% dextransulfat løsning for hver 100 μL), 1X Denhardt løsning, 50 mM natriumfosfat pH 7,0,2X natriumcitrat (SSC), 20 mikrogram klippet laks sædceller DNA (SSSD) og 20 g gær tRNA. </li><li> Hver af de dele af HB har et andet formål. Formamid sænker smeltepunktet for nukleinsyre rækkehuse dermed bidrage med denaturering af RNA og minimere celleskader. Dextransulfat bruges som en volumen-eksklusive polymer til at koncentrere sig sonden og øge hybridisering sats. Denhardts løsning, gær tRNA og SSSD tjene som et blokerende agenter til at reducere de ikke-specifik binding. </li><li> I hver af cellen resuspension-indeholdende 1,5 ml mikrocentrifugerør, tilsæt 95 μL HB og 5,0 μL af Srna / mRNA-specifikke LNA [20 pmol af specifikke LNA slutkoncentration] eller vand (for ingen LNA negativ kontrol). For eksempel: <ol class="lalpha"><li> Tube 1 til 95 μL HB + 5,0 μL Srna / mRNA-specifik probe </li><li> Tube 2 til 95 μL HB + 5,0 μL Srna / mRNA-specifik probe (nej dye &#39;negativ kontrol) </li><li> Tube 3 til 95 μL HB + 5,0 μL Srna/ MRNA sonde (»ikke-udtrykte Srna / mRNA &#39;negativ kontrol) </li><li> Tube fra 4 til 95 μL HB + 5,0 μL vand (nej LNA &#39;negativ kontrol) </li></ol></li></ol><ol start="4"><li> Inkuber alle fire prøver ved 60 ° C i 60 minutter. Den hybridisering temperatur afhænger af LNA sonde (r) T m og bør sættes til cirka 30 ° C under den forudsagte T m for RNA udglødning. Både forhøjet hybridisering temperatur og formamid i HB sikrer denaturering af sekundære struktur Srna eller mRNA af interesse. </li></ol> 6. Post-hybridisering vasker <ol><li> Efter hybridisering, 1,0 mL 0.1X SSC tilføje med 0,1% Tween-20 (SSCT) til hybridisering blandingen. Dette er nødvendigt for at gøre det muligt for celler, der skal fjernes fra tyktflydende hybridiseringsopløsning. Pelleter celler (7K, 2 min) og fjern supernatant. </li><li> Tilsæt 200 ml 50% formamid, 2X SSC, 0,1% Tween-20 til cellen pellets, bland grundigt og incubspiste i 30 minutter ved 65 ° C i en varmeblok. </li><li> Tilsæt 1 mL 0.1X SSCT til blandingen, pellet cellerne (7K, 2 min) og fjern supernatant. </li><li> Tilsæt 500 μL 0.1X SSCT til cellerne og inkuber i 40 minutter ved 65 ° C i en varmeblok. Pelleter celler (7K, 2 min) og fjern supernatant. </li></ol> 7. Blokering og farvning <ol><li> Forbered blokerende buffer (BB) og streptavidin-dye farvning løsning. Forbered en 1X BB løsning fra en 5x materiel (kommercielt tilgængelige, se Reagenser). For hvert sæt af fire rør, forberede 1,2 mL 1X BB. </li><li> Tilsæt 200 μL 1X BB til cellen pellets, resuspender og inkuber i 30 minutter ved 25 ° C. </li><li> En streptavidin-konjugeret farvestof bruges til at detektere biotinyleret LNA prober. Mens blokering, udarbejde en opløsning af 2 mg / ml DyLight 488 streptavidin eller din ønskede farve-streptavidin konjugat i 1X BB i 30 min (for tre prøver, 300 μL gøre). </li><li> Efter incubation med 1X BB, pellet cellerne (7K, 2 min) og fjern supernatant. Tilsæt 50 μL af streptavidin-dye-løsning til cellen pellets, bland grundigt, og inkuber i 12 minutter ved 25 ° C med konstant at blande på en hvirvel eller i en thermomixer. For &quot;ingen farve &#39;kontrol, tilsættes 50 μL 1X blokerende buffer kun. For resten af ​​protokollen, beskytte rørene mod lys ved hjælp af aluminiumsfolie. </li><li> Vask cellerne gang med 500 μL 0.1X SSCT buffer og en gang med 400 μL 1X PBS med 0,1% Tween-20 (PBST). Pelleter celler (7K, 2 min) og fjern supernatant. </li><li> Efter den indledende streptavidin-konjugat farvning, er signalet forstærkes ved at indføre en biotinyleret anti-streptavidin antistof til streptavidin-dye konjugat og derefter farvning anden gang med streptavidin-dye og dermed øge det signal output pr hybridiseret LNA sonde (figur 2) . </li><li> Tilsæt 100 μL af 1 mg / ml biotinyleret anti-streptavidin antistof i 1X PBS, resuspend cellerne, og inkuberes ved 25 ° C i 30 minutter med lejlighedsvise blanding. Pelleter celler (7K, 2 min), fjern supernatanten og vaske to gange med 400 μL 1X PBST. </li><li> Tilsæt 50 μL af de 2 mg / ml streptavidin-dye-løsning til cellerne, blandes grundigt, og inkuber i 12 minutter ved 25 ° C med konstant at blande på en hvirvel eller i en thermomixer. For &quot;ingen farve &#39;kontrol, tilsættes 50 μL 1X blokerende buffer kun. </li><li> Vask cellerne gang med 500 μL 0.1X SSCT buffer og en gang med 400 μL 1X PBST. </li><li> Cellerne i 200 μL 1X PBST og opbevares ved 4 ° C, indtil klar til flowcytometri analyse. For mindre bakterieceller indstille flowhastigheden til langsom til at mindske kernen størrelse. Hertil kommer, for flowcytometre med Forward Scatter tærskel cutoffs skal cutoff sættes så lavt som muligt for at sikre de små bakterieceller opdages. </li><li> For DyLight 488 detektion, bør flowcytometeret være udstyret med en 488 nm laser og standard-emissionfiltre til FITC. Mindst 2x10 4 arrangementer bør indsamles. For kompatibilitet med flowcytometre udstyret med forskellige lasere, kan andre streptavidin-konjugeret fluorophores skal bruges til denne protokol. </li></ol> 8. Repræsentative resultater Et eksempel på celler, der er faste og permeabilized effektivt vises i flowcytometri prikplot i figur 3A. Når du bruger de ovenfor beskrevne forudsætninger for permeabilization, cellen befolkningen er lille og homogen angiver få celle aggregater. Når højere (5 mg / ml) koncentrationer af lysozym er anvendt, celler er mere tilbøjelige til at samle og vise øget Forward Scatter værdier, vejledende af større partikler (figur 3B). Et eksempel på flowcytometri data fra en vellykket LNA flow-FISH forsøget, vises i Figur 4. Histogrammet viser den specifikke påvisning af et mål Srna sammen med tre negative kontroller.Det &#39;ingen farve&#39; negativ kontrol producerer den mindst fluorescens, efterfulgt af &#39;no LNA «og» ikke-udtrykte Srna&#39; negative kontroller. Endelig prøven med Srna-specifikke LNA sonde producerer den største fluorescens. Når metode og LNA prober er valideret på denne måde, kan yderligere eksperimenter være konstrueret til at overvåge ændringer i Srna signalet over tid, som svar på mutationer eller varieret dyrkningsbetingelser mv <img alt="Figur 1." src="/files/ftp_upload/3655/3655fig1.jpg" /> Figur 1. Skildring af den overordnede opbygning af en LNA flow-FISH eksperiment til detektion af bakteriel Srna. <img alt="Figur 2." src="/files/ftp_upload/3655/3655fig2.jpg" /> Figur 2. Farvning og forstærkning af LNA flow-FISH signal. a) hybridisering af de biotinyleret LNA sonden. b) Farvning med fluorescerende DyLight 488 streptavidin konjugat. c) Binding af biotinyleret anti-streptavidin antistof til DyLight 488 streptavidin. Antistoffet kan binde streptavidin gennem sin antigen-bindende sted eller kan være bundet af streptavidin gennem sin biotin rester. d) Forstærkning af signalet ved yderligere farvning med fluorescerende DyLight 488 streptavidin konjugat. <img alt="Figur 3." src="/files/ftp_upload/3655/3655fig3.jpg" /> Figur 3. Flowcytometri dot plot viser frem versus sidespredning resultater for a) 1 mg / mL lysozym, 3 mg / ml proteinase K permeabilization og b) 5 mg / mL lysozym, 3 mg / ml proteinase K permeabilization. <img alt="Figur 4." src="/files/ftp_upload/3655/3655fig4.jpg" /> Figur 4. Histogram analyse af LNA flow-FISH resultater. Den fluorescerende signal, der genereres fra hver prøve fremgår af de fire spor: sort - Srna-specifikke LNA probe, rød - »ikke-udtrykte Srna &#39;negativ kontrol, blå - nej LNA&#39; negativ kontrol lilla -Nej dye &#39;negativ kontrol.

<ol>
	<li>Rufer, N., Dragowska, W., Thornbury, G., Roosnek, E., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+length+dynamics+in+human+lymphocyte+subpopulations+measured+by+flow+cytometry.">Telomere length dynamics in human lymphocyte subpopulations measured by flow cytometry.</a> Nat. Biotechnol. 16, 743-747 (1998).</li><li>Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+telomere+length+of+human+chromosomes.">Heterogeneity in telomere length of human chromosomes.</a> Hum. Mol. Genet. 5, 685-691 (1996).</li><li>Pernthaler, A., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Fluorescence+In+Situ+Hybridization+of+mRNA+and+rRNA+in+Environmental+Bacteria.">Simultaneous Fluorescence In Situ Hybridization of mRNA and rRNA in Environmental Bacteria.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 5426-5433 (2004).</li><li>Jen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-FISH+analysis+and+isolation+of+clostridial+strains+in+an+anaerobic+semi-solid+bio-hydrogen+producing+system+by+hydrogenase+gene+target.">Flow-FISH analysis and isolation of clostridial strains in an anaerobic semi-solid bio-hydrogen producing system by hydrogenase gene target.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 74, 1126-1134 (2007).</li><li>Robertson, K. L., Verhoeven, A. B., Thach, D., Chang, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Viral+RNA+in+Infected+Cells+with+LNA+Flow-FISH.">Monitoring Viral RNA in Infected Cells with LNA Flow-FISH.</a> RNA. 16, 1679-1685 (2010).</li><li>Friedrich, U., Lenke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Enumeration+of+Lactic+Acid+Bacteria+in+Mesophilic+Dairy+Starter+Cultures+by+Using+Multiplex+Quantitative+Real-Time+PCR+and+Flow+Cytometry-Fluorescence+In+Situ+Hybridization.">Improved Enumeration of Lactic Acid Bacteria in Mesophilic Dairy Starter Cultures by Using Multiplex Quantitative Real-Time PCR and Flow Cytometry-Fluorescence In Situ Hybridization.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 4163-4171 (2006).</li><li>Thomsen, R., Nielsen, P. S., Jensen, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatically+improved+RNA+in+situ+hybridization+signals+using+LNA-modified+probes.">Dramatically improved RNA in situ hybridization signals using LNA-modified probes.</a> RNA. 11, 1745-1748 (2005).</li><li>Silahtaroglu, A. N., Tommerup, N., Vissing, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISHing+with+locked+nucleic+acids+(LNA):+evaulation+of+different+LNA/DNA+mixmers.">FISHing with locked nucleic acids (LNA): evaulation of different LNA/DNA mixmers.</a> Mol. Cell. Probes. 17, 165-169 (2003).</li><li>Obika, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2'-O,+4'-C-methyleneuridine+and+-cytidine.+Novel+bicyclic+nucleosides+having+a+fixed+C3'-endo+sugar+puckering.">Synthesis of 2'-O, 4'-C-methyleneuridine and -cytidine. Novel bicyclic nucleosides having a fixed C3'-endo sugar puckering.</a> Tetrahedron. Lett. 38, 8735-8738 (1997).</li><li>Koshkin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LNA+(locked+nucleic+acids):+synthesis+of+the+adenine,+cytosine,+guanine,+5-methylcytosine,+thymine,+and+uracil+bicyclonucleoside+monomers+oligomerisation,+and+unprecedented+nucleic+acid+recognition.">LNA (locked nucleic acids): synthesis of the adenine, cytosine, guanine, 5-methylcytosine, thymine, and uracil bicyclonucleoside monomers oligomerisation, and unprecedented nucleic acid recognition.</a> Tetrahedron. 54, 3607-3630 (1998).</li><li>Kubota, K., Ohashi, A., Imachi, H., Harada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+in+situ+hybridization+efficiency+with+locked-nucleic-acid-incorporated+DNA+probes.">Improved in situ hybridization efficiency with locked-nucleic-acid-incorporated DNA probes.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 5311-5317 (2006).</li><li>Robertson, K. L., Thach, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LNA+flow-FISH:+A+flow+cytometry-fluorescence+in+situ+hybridization+method+to+detect+messenger+RNA+using+locked+nucleic+acid+probes.">LNA flow-FISH: A flow cytometry-fluorescence in situ hybridization method to detect messenger RNA using locked nucleic acid probes.</a> Anal. Biochem. 390, 109-114 (2009).</li><li>Waters, L., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+RNAs+in+bacteria.">Regulatory RNAs in bacteria.</a> Cell. 136, 615-628 (2009).</li><li>Petersen, M., Wengel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LNA:+a+versatile+tool+for+therapeutics+and+genomics.">LNA: a versatile tool for therapeutics and genomics.</a> Trends. Biotechnol. 21, 74-81 (2003).</li><li>Corput, M. P. C. v. d., Grosveld, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+Situ+Hybridization+Analysis+of+Transcript+Dynamics+in+Cells.">Fluorescence in Situ Hybridization Analysis of Transcript Dynamics in Cells.</a> Methods. 25, 111-118 (2001).</li><li>Silveira, A. C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+non-coding+RNAs+in+environmental+vibrios.">Identification of non-coding RNAs in environmental vibrios.</a> Microbiology. 156, 2452-2458 (2010).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

LNA flow-FISH-metoden præsenteres her blev brugt til at registrere udtryk for et Srna fra Gram-negative marine bakterie, Vibrio campbellii hvis udtryk er tidligere blevet bekræftet via microarray-baserede udtryk profilering og reverse transcription polymerase chain reaction 16. Til dato har vi brugt denne metode til at overvåge udtryk for en bred vifte af RNA (fx trans-kodet Srna, Srna, som modulerer protein aktivitet, riboswitches, og mRNA). Som sådan, er vi overbeviste om, at metoden er fleksibel og kan bruges til at afsløre eventuelle Srna eller mRNA target og kan være modificeret til brug i alle bakteriearter eller celletype. Hvis ændring af denne protokol er nødvendigt for andre celletyper, at den vigtigste variabel til at overveje at manipulere er permeabilization skridt. For eksempel, når ændre permeabilization betingelser, der er beskrevet her, skal ændringer i koncentrationen af ​​lysozym og proteinase K testes. Vi fandt, at en fordobling ellertredobling mængden af ​​lysozym og proteinase K har resulteret i væsentlige ændringer i LNA flow-FISH resultater. Desuden ved test yderligere permeabilization betingelser, bør cellerne skal analyseres for sammenklumpning celletab, og den bedst opnåelige signal til baggrundsfluorescens ratio. Omfanget af cellen sammenklumpning kan testes ved mikroskopi og / eller flowcytometri. Ved flowcytometri, er celle klumper stede som haler i en fremadrettet vs sidespredning prikplot og den korrekte permeabilization metode vil minimere denne hale effekt. Denne metode er også muligt at foretage en multiplex Srna detektion uden store ændringer i den beskrevne protokol, som yderligere LNA prober mærket med andre haptens såsom digoxigenin kunne tilføjes under hybridisering trin og derefter opdages med en anti-digoxigenin antistof og sekundært antistof-fluoroforen konjugat. I øjeblikket er den eneste begrænsning, vi har mødt med denne metode er dens manglende evne til at generere tilstrækkelig signal fra svagt expressede Srna arter og indsats i gang for at bestemme detektionsgrænsen (i absolutte antal kopier per celle). Samlet set LNA flow-FISH-metoden giver mulighed for at måle bakteriel Srna eller mRNA udtryk på enkelt-celle-niveau i et high throughput måde at give indsigt om tilstedeværelsen og relative forekomst af en Srna arter og i hvor høj grad sit udtryk varierer i en befolkning.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagenset </td><td> Firma </td><td> Katalog nummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> 10X fosfatbufferet saltopløsning (PBS), pH 7,4 </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9625 </td><td></td></tr><tr><td> Nuklease-frit vand </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9932 </td><td> (Ikke DEPC behandlet) </td></tr><tr><td> 32% paraformaldehyd </td><td> Electron Microscopy Fakultet </td><td> RT 15714 </td><td> Ethanol gratis </td></tr><tr><td> Eddikesyre </td><td> ACROS Organics </td><td> 327290010 </td><td></td></tr><tr><td> Diethylmaleat pyrocarbonate (DEPC) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D5758 </td><td&gt; Hold udtørret </td></tr><tr><td> Lysozym </td><td> Sigma Aldrich </td><td> L2879 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K (20 mg / ml) </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM2546 </td><td></td></tr><tr><td> Formamid </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9342 </td><td> Deioniseret, alikvot og fryse </td></tr><tr><td> Dextransulfat MW&gt; 500.000 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D8906 </td><td> Alikvot 60% opløsning og fryse </td></tr><tr><td> Denhardt løsning 50X koncentrat </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D2532 </td><td> Portion og frys </td></tr><tr><td> Natriumcitrat buffer 20X </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9770 </td><td></td></tr><tr> &lt;td&gt; Laks sperm DNA (klippet) 10 mg / ml </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9680 </td><td> Portion og frys </td></tr><tr><td> Gær tRNA (10 mg / ml) </td><td> Life Technologies / Invitrogen </td><td> 15401-011 </td><td> Portion og frys </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> 5X in situ hybridisering blokerende opløsning </td><td> Vector Laboratories </td><td> MB-1220 </td><td></td></tr><tr><td> DyLight 488 streptavidin </td><td> Vector Laboratories </td><td> SA-5488-1 </td><td></td></tr><tr><td> Biotinyleret anti-streptavidin </td><td> Vector Laboratories </td><td> BA-0500 </td><td> Portion og frys </td></tr></tbody></table>

locked nucleic acid flow cytometry-fluorescence in situ hybridization (lna flow-fish): a method for bacterial small rna detection

Fluorescens in situ hybridisering (FISH) er en kraftfuld teknik, der bruges til at registrere og lokalisere specifikke nukleinsyresekvenser i den cellulære miljø. For at øge gennemløb, kan FISH kombineres med flowcytometri (flow-FISH) for at muliggøre påvisning af målrettede nukleinsyresekvenser i tusindvis af de enkelte celler. Som et resultat tilbyder flow-FISH en klar fordel i forhold til lysat / ensemble-baserede nukleinsyre metoder til påvisning, fordi hver celle er behandlet som en uafhængig observation, og dermed tillader stærkere statistiske og varians analyser. Disse egenskaber har bedt om brugen af FISH og flow-FISH metoder i en række forskellige applikationer og nytten af disse metoder er blevet påvist i telomer længde beslutsomhed 1,2, cellulære identifikation og genekspression 3,4, overvågning viral formering i inficerede celler 5, og bakterielle samfund analyser og tælling6. Traditionelt har de særlige forhold, FISH og flow-FISH metoder blevet bibringes i form af DNA-oligonukleotid sonder. For nylig har dog udskiftning af DNA-oligonukleotid sonder med nukleinsyre-analoger som fisk og flow-FISH prober øgede både følsomheden og specificiteten af hver teknik på grund af de højere smeltepunkter (T m) af disse analoger til naturlig nukleinsyrer 7,8 . Locked Nucleic Acid (LNA) sonder er en type af nukleinsyre analog, der indeholder LNA-nukleotider spiked igennem en DNA-eller RNA-sekvens 9,10. I kombination med flow-FISH, har LNA prober tidligere været vist at overgå konventionelle DNA-sonder 7,11 og med succes er blevet brugt til at detektere eukaryote mRNA 12 og viral RNA i mammale celler 5. Her kan vi udvide denne mulighed og beskrive en LNA flow-FISH metode, som tillader specifikke påvisning af RNA i bakterielle celles (Figur 1). Konkret er vi interesserede i at påvisning af små ikke-kodende regulerende RNA (Srna), som har høstet stor interesse i de seneste par år, da de har vist sig at fungere som vigtige lovgivningsmæssige elementer i mange kritiske cellulære processer 13. Der er dog begrænsede værktøjer til at undersøge sRNAs og de udfordringer, opdage Srna i bakterieceller skyldes til dels den relativt lille størrelse (typisk 50-300 nukleotider i længde) og lav overflod af Srna molekyler samt den generelle vanskeligheder med at arbejde med mindre biologiske celler med varierende cellulære membraner. I denne metode, beskriver vi fiksering og permeabilzation betingelser, der bevarer strukturen af bakterieceller og tillade gennemtrængning af LNA sonder samt signalforstærkning skridt, som gør det muligt for specifikke påvisning af lav tæthed Srna (Figur 2).

Watch this Scientific Journal Video about Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection at JoVE.com

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

En roman high-throughput Metoden er beskrevet som gør det muligt at afsløre og relative kvantificering af små RNA og mRNA udtryk fra enkelt bakterieceller ved hjælp af Locked Nucleic Acid sonder og flowcytometri-fluorescens<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering.

Locked Nucleic Acid Flowcytometri-fluorescens In situ Hybridisering (LNA flow-FISH): En metode til bakteriel små RNA Detection

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Transfection and Mutagenesis of Target Genes in Mosquito Cells by Locked Nucleic Acid-modified Oligonucleotides

Plasmodium parasites, the causative agent of malaria, are transmitted through the bites of infected Anopheles mosquitoes resulting in over 250 million new ...

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Hybridisering<em&gt; In situ</em&gt; Af spytkirtler, æggestokke og embryoner af Vector Myg

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering på mitotiske kromosomer af myg

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Bakteriel kunstige kromosomer: En funktionel Genomics værktøj for Studiet af Positiv-RNA-vira

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

Hurtig, sikker og simpel manuel sengelamper nukleinsyre udvinding til påvisning af Virus i blodprøver

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Kvantitativ fluorescens in situ-hybridisering (fisk) og immunofluorescens (IF) af specifikke genprodukter i KSHV-inficerede celler

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

Modeling Hepatitis B Virus Infection in Non-Hepatic 293T-NE-3NRs Cells

Modellering Hepatitis B Virus Infektion i ikke-hepatisk 293T-NE-3NRs celler

HBV mainly infects human hepatocytes, but it has also been found to infect extrahepatic tissues such as kidney and testis. Nonetheless, cell-based HBV ...

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

En ikke-kodende lille RNA-mikrofon bidrager til virulens i ydre membranproteiner i Salmonella enteritidis

A non-coding small RNA (sRNA) is a new factor to regulate gene expression at the post-transcriptional level. A kind of sRNA MicC, known in Escherichia ...