Name: locked nucleic acid flow cytometry-fluorescence in situ hybridization (lna flow-fish): a method for bacterial small rna detection
Uploaded: 2012-01-10T13:00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי משרד המחקר של הצי הימי של ארה&quot;ב באמצעות כספים במעבדת המחקר הליבה.

<ol>
	<li>Rufer, N., Dragowska, W., Thornbury, G., Roosnek, E., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+length+dynamics+in+human+lymphocyte+subpopulations+measured+by+flow+cytometry.">Telomere length dynamics in human lymphocyte subpopulations measured by flow cytometry.</a> Nat. Biotechnol. 16, 743-747 (1998).</li><li>Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+telomere+length+of+human+chromosomes.">Heterogeneity in telomere length of human chromosomes.</a> Hum. Mol. Genet. 5, 685-691 (1996).</li><li>Pernthaler, A., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Fluorescence+In+Situ+Hybridization+of+mRNA+and+rRNA+in+Environmental+Bacteria.">Simultaneous Fluorescence In Situ Hybridization of mRNA and rRNA in Environmental Bacteria.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 5426-5433 (2004).</li><li>Jen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-FISH+analysis+and+isolation+of+clostridial+strains+in+an+anaerobic+semi-solid+bio-hydrogen+producing+system+by+hydrogenase+gene+target.">Flow-FISH analysis and isolation of clostridial strains in an anaerobic semi-solid bio-hydrogen producing system by hydrogenase gene target.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 74, 1126-1134 (2007).</li><li>Robertson, K. L., Verhoeven, A. B., Thach, D., Chang, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Viral+RNA+in+Infected+Cells+with+LNA+Flow-FISH.">Monitoring Viral RNA in Infected Cells with LNA Flow-FISH.</a> RNA. 16, 1679-1685 (2010).</li><li>Friedrich, U., Lenke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Enumeration+of+Lactic+Acid+Bacteria+in+Mesophilic+Dairy+Starter+Cultures+by+Using+Multiplex+Quantitative+Real-Time+PCR+and+Flow+Cytometry-Fluorescence+In+Situ+Hybridization.">Improved Enumeration of Lactic Acid Bacteria in Mesophilic Dairy Starter Cultures by Using Multiplex Quantitative Real-Time PCR and Flow Cytometry-Fluorescence In Situ Hybridization.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 4163-4171 (2006).</li><li>Thomsen, R., Nielsen, P. S., Jensen, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatically+improved+RNA+in+situ+hybridization+signals+using+LNA-modified+probes.">Dramatically improved RNA in situ hybridization signals using LNA-modified probes.</a> RNA. 11, 1745-1748 (2005).</li><li>Silahtaroglu, A. N., Tommerup, N., Vissing, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISHing+with+locked+nucleic+acids+(LNA):+evaulation+of+different+LNA/DNA+mixmers.">FISHing with locked nucleic acids (LNA): evaulation of different LNA/DNA mixmers.</a> Mol. Cell. Probes. 17, 165-169 (2003).</li><li>Obika, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2'-O,+4'-C-methyleneuridine+and+-cytidine.+Novel+bicyclic+nucleosides+having+a+fixed+C3'-endo+sugar+puckering.">Synthesis of 2'-O, 4'-C-methyleneuridine and -cytidine. Novel bicyclic nucleosides having a fixed C3'-endo sugar puckering.</a> Tetrahedron. Lett. 38, 8735-8738 (1997).</li><li>Koshkin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LNA+(locked+nucleic+acids):+synthesis+of+the+adenine,+cytosine,+guanine,+5-methylcytosine,+thymine,+and+uracil+bicyclonucleoside+monomers+oligomerisation,+and+unprecedented+nucleic+acid+recognition.">LNA (locked nucleic acids): synthesis of the adenine, cytosine, guanine, 5-methylcytosine, thymine, and uracil bicyclonucleoside monomers oligomerisation, and unprecedented nucleic acid recognition.</a> Tetrahedron. 54, 3607-3630 (1998).</li><li>Kubota, K., Ohashi, A., Imachi, H., Harada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+in+situ+hybridization+efficiency+with+locked-nucleic-acid-incorporated+DNA+probes.">Improved in situ hybridization efficiency with locked-nucleic-acid-incorporated DNA probes.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 5311-5317 (2006).</li><li>Robertson, K. L., Thach, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LNA+flow-FISH:+A+flow+cytometry-fluorescence+in+situ+hybridization+method+to+detect+messenger+RNA+using+locked+nucleic+acid+probes.">LNA flow-FISH: A flow cytometry-fluorescence in situ hybridization method to detect messenger RNA using locked nucleic acid probes.</a> Anal. Biochem. 390, 109-114 (2009).</li><li>Waters, L., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+RNAs+in+bacteria.">Regulatory RNAs in bacteria.</a> Cell. 136, 615-628 (2009).</li><li>Petersen, M., Wengel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LNA:+a+versatile+tool+for+therapeutics+and+genomics.">LNA: a versatile tool for therapeutics and genomics.</a> Trends. Biotechnol. 21, 74-81 (2003).</li><li>Corput, M. P. C. v. d., Grosveld, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+Situ+Hybridization+Analysis+of+Transcript+Dynamics+in+Cells.">Fluorescence in Situ Hybridization Analysis of Transcript Dynamics in Cells.</a> Methods. 25, 111-118 (2001).</li><li>Silveira, A. C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+non-coding+RNAs+in+environmental+vibrios.">Identification of non-coding RNAs in environmental vibrios.</a> Microbiology. 156, 2452-2458 (2010).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

השיטה זרימה FISH LNA המוצג כאן נעשה שימוש כדי לאתר את הביטוי של sRNA מן גראם שליליים ימיים החיידק Vibrio campbellii אשר הביטוי כבר בעבר אישרו דרך פרופיל microarray המבוסס על הביטוי שעתוק לאחור polymerase תגובת שרשרת 16. עד כה השתמשנו בשיטה זו כדי לעקוב אחר הביטוי של מגוון רחב של RNAs (למשל טרנס מקודד sRNA, sRNA כי לווסת את פעילות החלבון, riboswitches, ו-mRNA). ככזה, אנו בטוחים כי השיטה ניתנת להתאמה והוא יכול לשמש כדי לזהות כל יעד sRNA או mRNA והוא יכול להיות שונה לשימוש בכל מיני חיידקים או סוג תא. אם שינוי של פרוטוקול זה הוא הכרחי עבור סוגי תאים אחרים, המשתנה החשוב ביותר לשקול מניפולציה היא הצעד permeabilization. לדוגמה, כאשר שינוי תנאי permeabilization המתואר כאן, שינויים בריכוזים של ליזוזים ו proteinase K צריך להיבדק. מצאנו כי הכפלת אושילש את כמות ליזוזים ו proteinase K הביא שינויים משמעותיים הזרימה-FISH תוצאות LNA. יתר על כן, כאשר בדיקות permeabilization תנאים נוספים, התאים יש לנתח עבור clumping, אובדן התא האות השגה הטוב ביותר יחס רקע פלואורסצנטי. היקף clumping התא יכול להיבדק על ידי מיקרוסקופיה / או cytometry הזרימה. עד cytometry זרימה, גושים תא קיימים כמו זנבות של קדימה לעומת פיזור נקודה בצד העלילה ואת שיטת permeabilization הנכון יהיה למזער את האפקט הזה עוקב. שיטה זו היא גם מקובל זיהוי זמנית sRNA בלי שינויים גדולים לפרוטוקול כמתואר בדיקות נוספות LNA שכותרתו עם haptens אחרים כגון digoxigenin ניתן להוסיף במהלך שלב הכלאה ו זוהה אז עם נוגדן אנטי digoxigenin ו המצומד משני נוגדנים fluorophore. נכון לעכשיו, המגבלה היחידה שאנו נתקלים בשיטה זו היא חוסר יכולתה ליצור אות מספקת מצד לשעבר חלושותמינים sRNA נלחץ מאמצים נערכים כדי לקבוע את סף זיהוי (מספר העתק מוחלט לכל תא). בסך הכל, את שיטת תזרים LNA-FISH מספקת את ההזדמנות כדי למדוד sRNA חיידקי או ביטוי mRNA ברמת תא בודד באופן תפוקה גבוהה, כדי לספק תובנות על נוכחות השפע היחסי של מינים sRNA ואת מידת הביטוי שלו משתנה באוכלוסייה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> פוספט 10X שנאגרו מלוחים (PBS), pH 7.4 </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9625 </td><td></td></tr><tr><td> Nuclease ללא מים </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9932 </td><td> (לא DEPC מטופלים) </td></tr><tr><td> 32% paraformaldehyde </td><td> מיקרוסקופית אלקטרונים למדעים </td><td> RT 15714 </td><td> אתנול חינם </td></tr><tr><td> חומצה אצטית </td><td> Acros אורגניקס </td><td> 327290010 </td><td></td></tr><tr><td> Diethyl pyrocarbonate (DEPC) </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> D5758 </td><tד&gt; שמור מיובש </td></tr><tr><td> ליזוזים </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> L2879 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K (20 מ&quot;ג / מ&quot;ל) </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM2546 </td><td></td></tr><tr><td> לפוראמיד </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9342 </td><td> Aliquot Deionized, ולהקפיא </td></tr><tr><td> Dextran סולפט MW&gt; 500.000 </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> D8906 </td><td> Aliquot פתרון 60% ולהקפיא </td></tr><tr><td> 50X פתרון Denhardt נתרכז </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> D2532 </td><td> Aliquot ולהקפיא </td></tr><tr><td> סודיום ציטרט חיץ 20X </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9770 </td><td></td></tr><tr> &lt;td&gt; זרע DNA סלמון (טעון) 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9680 </td><td> Aliquot ולהקפיא </td></tr><tr><td> שמרים tRNA (10 מ&quot;ג / מ&quot;ל) </td><td> Life Technologies / Invitrogen </td><td> 15401-011 </td><td> Aliquot ולהקפיא </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> 5X בפתרון הכלאה באתרו חסימת </td><td> וקטור מעבדות </td><td> MB-1220 </td><td></td></tr><tr><td> DyLight 488 streptavidin </td><td> וקטור מעבדות </td><td> SA-5488-1 </td><td></td></tr><tr><td> Biotinylated אנטי streptavidin </td><td> וקטור מעבדות </td><td> BA-0500 </td><td> Aliquot ולהקפיא </td></tr></tbody></table>

locked nucleic acid flow cytometry-fluorescence in situ hybridization (lna flow-fish): a method for bacterial small rna detection

הקרינה הכלאה באתרו (FISH) היא טכניקה רבת עוצמה המשמש לזהות בתרגום ספציפי רצפי חומצות גרעין בסביבה הסלולרית. על מנת להגדיל את התפוקה, דגים ניתן לשלב עם cytometry זרימה (flow-FISH) כדי לאפשר את זיהוי ממוקד של רצפי חומצות גרעין אלפי תאים בודדים. כתוצאה מכך, תזרים-FISH מציעה יתרון בולט על פני lysate / אנסמבל מבוססי חומצת גרעין לזיהוי שיטות כי כל תא היא כאל תצפית עצמאית, ובכך לאפשר ניתוח סטטיסטי ושונות חזק. תכונות אלה גרמו שימוש בשיטות דגים זרימה דגים במספר יישומים שונים בכלי של שיטות אלה הודגמה בהצלחה בזיהוי הטלומרים קביעת אורך, 1,2 הסלולר ביטוי גנים 3,4, ניטור כפל ויראלי תאים נגועים 5, וניתוח הקהילה ספירת חיידקים6. באופן מסורתי, סגוליות של שיטות דגים זרימה דגים כבר הנחילה ידי בדיקות דנ&quot;א oligonucleotide. ואולם, החלפת oligonucleotide בדיקות DNA עם אנלוגים של חומצות גרעין כמו בדיקות דגים זרימה FISH גדל הן רגישות וספציפיות של טכניקה זו בשל הטמפרטורות היתוך גבוהה (T מ &#39;) של אנלוגים אלו חומצות גרעין טבעי 7,8 . חומצות גרעין נעול (LNA) בדיקות הן סוג של חומצות גרעין אנלוגי המכילים נוקלאוטידים LNA זינק לאורך רצף ה-DNA או RNA 9,10. בשילוב עם דגים זרימה, בדיקות LNA בעבר הוכח להכות בדיקות דנ&quot;א קונבנציונלי 7,11 ו כבר השתמשו בהצלחה כדי לזהות mRNA אוקריוטים 12 ו-RNA נגיפי בתאי יונקים 5. כאן אנו להרחיב את יכולת לתאר שיטה זרימה FISH LNA אשר מאפשר זיהוי ספציפי של RNA בתא החיידקs (איור 1). באופן ספציפי, אנו מעוניינים זיהוי של קטן ללא קידוד הרגולציה RNA (sRNA) אשר משכו עניין רב בשנים האחרונות כפי שהם נמצאו לשמש גורמים רגולטוריים מרכזיים רבים תהליכים תאיים קריטי 13. עם זאת, יש כלים מוגבלים ללמוד sRNAs ואת האתגרים של גילוי sRNA בתאי החיידקים נובע בחלקו לגודל קטן יחסית (בדרך כלל 5-30 נוקלאוטידים אורך) ושפע נמוך של מולקולות sRNA כמו גם את הקושי הכללי בעבודה עם תאים ביולוגיים קטנים יותר עם משתנים ממברנות התאים. בשיטה זו, אנו מתארים קיבעון ו permeabilzation התנאים לשמר את המבנה של תאים חיידקיים ולאפשר את חדירת בדיקות LNA, כמו גם הגברה אות צעדים המאפשרים זיהוי ספציפי של שפע sRNA נמוך (איור 2).

Watch this Scientific Journal Video about Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection at JoVE.com

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

שיטה חדשנית תפוקה גבוהה מתואר המאפשר איתור quantitation היחסי של RNA קטנים ביטוי mRNA של תאים חיידקיים יחיד באמצעות נעול בדיקות חומצות גרעין תזרים cytometry פלואורסצנציה<em&gt; באתרו</emהכלאה&gt;.

נעול חומצות גרעין תזרים cytometry פלואורסצנציה באתרו</emהכלאה> (LNA זרימה FISH): שיטה לגילוי חיידקי RNA קטנים

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

שילוב של הדגימה דבק קלטת מבוססי פלואורסצנטי באתרו הכלאה עבור איתור מהיר של סלמונלה על תוצרת טרייה

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Transfection and Mutagenesis of Target Genes in Mosquito Cells by Locked Nucleic Acid-modified Oligonucleotides

Transfection ו mutagenesis של גני מטרה של תאים על ידי יתוש נעול חומצה שונה oligonucleotides גרעין

Plasmodium parasites, the causative agent of malaria, are transmitted through the bites of infected Anopheles mosquitoes resulting in over 250 million new ...

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

&quot;Bioluminescent&quot; כתב phage לצורך זיהוי של קטגוריה פתוגנים חיידקיים

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

הכלאה<em&gt; באתרו</em&gt; של בלוטות הרוק, השחלות, ועוברים של וקטור יתושים

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

פלואורני<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה על כרומוזומים mitotic של יתושים

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

חיידקים מלאכותיים כרומוזומים: Genomics כלי פונקציונלי לחקר חיובי גדיל RNA וירוסים

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

חילוץ מהיר, בטוח, ופשוט ידנית המיטה חומצת גרעין איתור וירוס בדגימות דם מלא

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

פלואורסצנטית כמותי באתרו היברידיזציה (דג) ו Immunofluorescence (IF) של מוצרים גנטיים ספציפיים בתאים שנדבקו KSHV

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

Modeling Hepatitis B Virus Infection in Non-Hepatic 293T-NE-3NRs Cells

דוגמנות דלקת כבד B וירוס ב-t-הפטיטיס 293T-NE-3NRs תאים

HBV mainly infects human hepatocytes, but it has also been found to infect extrahepatic tissues such as kidney and testis. Nonetheless, cell-based HBV ...

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

RNA קטן שאינו מקודד תורם לאלימות בחלבוני הממברנה החיצונית בסלמונלה אנטריטידיס

A non-coding small RNA (sRNA) is a new factor to regulate gene expression at the post-transcriptional level. A kind of sRNA MicC, known in Escherichia ...

נעול חומצות גרעין תזרים cytometry פלואורסצנציה באתרו (LNA זרימה FISH): שיטה לגילוי חיידקי RNA קטנים