Name: locked nucleic acid flow cytometry-fluorescence in situ hybridization (lna flow-fish): a method for bacterial small rna detection
Uploaded: 2012-01-10T13:00:00
Duration: 9 min 45 s
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यह काम अमेरिकी नौसेना अनुसंधान प्रयोगशाला कोर धन के माध्यम से नौसेना अनुसंधान के कार्यालय द्वारा समर्थित किया गया.

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	<li>Rufer, N., Dragowska, W., Thornbury, G., Roosnek, E., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+length+dynamics+in+human+lymphocyte+subpopulations+measured+by+flow+cytometry.">Telomere length dynamics in human lymphocyte subpopulations measured by flow cytometry.</a> Nat. Biotechnol. 16, 743-747 (1998).</li><li>Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+telomere+length+of+human+chromosomes.">Heterogeneity in telomere length of human chromosomes.</a> Hum. Mol. 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Probes. 17, 165-169 (2003).</li><li>Obika, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2'-O,+4'-C-methyleneuridine+and+-cytidine.+Novel+bicyclic+nucleosides+having+a+fixed+C3'-endo+sugar+puckering.">Synthesis of 2'-O, 4'-C-methyleneuridine and -cytidine. Novel bicyclic nucleosides having a fixed C3'-endo sugar puckering.</a> Tetrahedron. Lett. 38, 8735-8738 (1997).</li><li>Koshkin, A. 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Microbiol. 72, 5311-5317 (2006).</li><li>Robertson, K. L., Thach, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LNA+flow-FISH:+A+flow+cytometry-fluorescence+in+situ+hybridization+method+to+detect+messenger+RNA+using+locked+nucleic+acid+probes.">LNA flow-FISH: A flow cytometry-fluorescence in situ hybridization method to detect messenger RNA using locked nucleic acid probes.</a> Anal. Biochem. 390, 109-114 (2009).</li><li>Waters, L., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+RNAs+in+bacteria.">Regulatory RNAs in bacteria.</a> Cell. 136, 615-628 (2009).</li><li>Petersen, M., Wengel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LNA:+a+versatile+tool+for+therapeutics+and+genomics.">LNA: a versatile tool for therapeutics and genomics.</a> Trends. Biotechnol. 21, 74-81 (2003).</li><li>Corput, M. P. C. v. d., Grosveld, F. 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लेखकों खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

LNA के प्रवाह मछली विधि यहाँ प्रस्तुत करने के लिए ग्राम नकारात्मक समुद्री जीवाणु विब्रियो campbellii जिनकी अभिव्यक्ति पहले माइक्रोएरे आधारित अभिव्यक्ति की रूपरेखा और रिवर्स प्रतिलेखन पोलीमरेज़ चेन प्रतिक्रिया 16 के माध्यम से पुष्टि की गई है से एक sRNA की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था. तिथि करने के लिए, हम इस पद्धति का इस्तेमाल किया है (जैसे पार इनकोडिंग sRNA, sRNA है कि प्रोटीन की गतिविधि, riboswitches, और mRNA मिलाना) RNAs के एक किस्म की अभिव्यक्ति की निगरानी. जैसे, हम विश्वास है कि विधि अनुकूलनीय है और किसी भी sRNA mRNA या लक्ष्य का पता लगाने और किसी भी बैक्टीरियल प्रजातियों या सेल प्रकार में उपयोग के लिए संशोधित किया जा सकता इस्तेमाल किया जा सकता हैं. यदि इस प्रोटोकॉल के संशोधन के अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए आवश्यक है, सबसे महत्वपूर्ण चर करने के लिए छेड़खानी पर विचार permeabilization कदम है. उदाहरण के लिए, जब permeabilization यहाँ वर्णित शर्तों को संशोधित, lysozyme proteinase और कश्मीर की सांद्रता में परिवर्तन का परीक्षण किया जाना चाहिए. हम जानते हैं कि दोहरीकरण या पायाlysozyme proteinase और कश्मीर की राशि तीन गुना LNA के प्रवाह मछली परिणामों में प्रमुख परिवर्तन के परिणामस्वरूप. इसके अलावा, जब अतिरिक्त permeabilization शर्तों परीक्षण, कोशिकाओं clumping, सेल, हानि, और पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति अनुपात करने के लिए सबसे अच्छा प्राप्य संकेत करने के लिए विश्लेषण किया जाना चाहिए. सेल clumping की हद माइक्रोस्कोपी और / या प्रवाह cytometry द्वारा परीक्षण किया जा सकता है. प्रवाह cytometry करके, सेल clumps मौजूद है के रूप में एक आगे की ओर तितर बितर डॉट साजिश और सही permeabilization विधि बनाम में पूंछ इस पीछा प्रभाव को कम करेगा. इस विधि भी मल्टीप्लेक्स में वर्णित प्रोटोकॉल के लिए प्रमुख संशोधनों के बिना sRNA पता लगाने के लिए उत्तरदायी है के रूप में अतिरिक्त LNA digoxigenin जैसे अन्य haptens के साथ लेबल जांच संकरण चरण के दौरान जोड़ा जा सकता है और फिर एक एंटीबॉडी विरोधी और माध्यमिक एंटीबॉडी fluorophore संयुग्म digoxigenin के साथ पकड़ा. वर्तमान में, केवल सीमा है कि हम इस विधि के साथ सामना करना पड़ा है अपनी दुर्बलता से पूर्व से पर्याप्त संकेत उत्पन्न असमर्थता हैदबाया sRNA प्रजातियों और प्रयासों का पता लगाने दहलीज (सेल प्रति निरपेक्ष प्रतिलिपि संख्या में) निर्धारित करने के लिए चल रहे हैं. कुल मिलाकर, LNA विधि प्रवाह मछली के लिए एक उच्च throughput उपस्थिति और एक sRNA प्रजातियों के रिश्तेदार बहुतायत और डिग्री है जो अपनी अभिव्यक्ति बदलता है पर अंतर्दृष्टि प्रदान करने के तरीके में एकल सेल स्तर पर उपाय बैक्टीरियल sRNA या mRNA अभिव्यक्ति का अवसर प्रदान करता है एक जनसंख्या में.

<table border="1"><tbody><tr><td> अभिकर्मक के नाम </td><td> कंपनी </td><td> सूचीपत्र संख्या </td><td> टिप्पणियाँ </td></tr><tr><td> 10X फास्फेट (पीबीएस) खारा, 7.4 पीएच buffered </td><td> एप्लाइड Biosystems / Ambion </td><td> AM9625 </td><td></td></tr><tr><td> Nuclease - मुफ्त पानी </td><td> एप्लाइड Biosystems / Ambion </td><td> AM9932 </td><td> (इलाज DEPC नहीं) </td></tr><tr><td> 32% paraformaldehyde </td><td> इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विज्ञान </td><td> 15714 आरटी </td><td> इथेनॉल मुक्त </td></tr><tr><td> एसिटिक एसिड </td><td> Acros ऑर्गेनिक्स </td><td> 327290010 </td><td></td></tr><tr><td> Diethyl pyrocarbonate (DEPC) </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> D5758 </td><tघ रखें&gt; desiccated </td></tr><tr><td> Lysozyme </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> L2879 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinase कश्मीर (20 मिलीग्राम / एमएल) </td><td> एप्लाइड Biosystems / Ambion </td><td> AM2546 </td><td></td></tr><tr><td> Formamide </td><td> एप्लाइड Biosystems / Ambion </td><td> AM9342 </td><td> विआयनीकृत विभाज्य, और फ्रीज </td></tr><tr><td> Dextran सल्फेट&gt; मेगावाट 500.000 </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> D8906 </td><td> अशेष भाजक 60% समाधान और स्थिर </td></tr><tr><td> Denhardt समाधान 50X ध्यान केंद्रित </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> D2532 </td><td> अशेष भाजक और स्थिर </td></tr><tr><td> सोडियम साइट्रेट बफर 20X </td><td> एप्लाइड Biosystems / Ambion </td><td> AM9770 </td><td></td></tr><tr> &lt;td&gt; सलमोन शुक्राणु डीएनए (sheared) 10 मिलीग्राम / एमएल </td><td> एप्लाइड Biosystems / Ambion </td><td> AM9680 </td><td> अशेष भाजक और स्थिर </td></tr><tr><td> खमीर tRNA (10 मिलीग्राम / एमएल) </td><td> जीवन टेक्नोलॉजीज / Invitrogen </td><td> 15401-011 </td><td> अशेष भाजक और स्थिर </td></tr><tr><td> बीच - 20 </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> स्वस्थानी संकरण अवरुद्ध समाधान में 5X </td><td> वेक्टर प्रयोगशालाओं </td><td> MB-१२२० </td><td></td></tr><tr><td> DyLight 488 streptavidin </td><td> वेक्टर प्रयोगशालाओं </td><td> एसए ५४८८-1 </td><td></td></tr><tr><td> Biotinylated विरोधी-streptavidin </td><td> वेक्टर प्रयोगशालाओं </td><td> बीए 0500 </td><td> अशेष भाजक और स्थिर </td></tr></tbody></table>

locked nucleic acid flow cytometry-fluorescence in situ hybridization (lna flow-fish): a method for bacterial small rna detection

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular environment. In order to increase throughput, FISH can be combined with flow cytometry (flow-FISH) to enable the detection of targeted nucleic acid sequences in thousands of individual cells. As a result, flow-FISH offers a distinct advantage over lysate/ensemble-based nucleic acid detection methods because each cell is treated as an independent observation, thereby permitting stronger statistical and variance analyses. These attributes have prompted the use of FISH and flow-FISH methods in a number of different applications and the utility of these methods has been successfully demonstrated in telomere length determination1,2, cellular identification and gene expression3,4, monitoring viral multiplication in infected cells5, and bacterial community analysis and enumeration6.
Traditionally, the specificity of FISH and flow-FISH methods has been imparted by DNA oligonucleotide probes. Recently however, the replacement of DNA oligonucleotide probes with nucleic acid analogs as FISH and flow-FISH probes has increased both the sensitivity and specificity of each technique due to the higher melting temperatures (Tm) of these analogs for natural nucleic acids7,8. Locked nucleic acid (LNA) probes are a type of nucleic acid analog that contain LNA nucleotides spiked throughout a DNA or RNA sequence9,10. When coupled with flow-FISH, LNA probes have previously been shown to outperform conventional DNA probes7,11 and have been successfully used to detect eukaryotic mRNA12 and viral RNA in mammalian cells5.
Here we expand this capability and describe a LNA flow-FISH method which permits the specific detection of RNA in bacterial cells (Figure 1). Specifically, we are interested in the detection of small non-coding regulatory RNA (sRNA) which have garnered considerable interest in the past few years as they have been found to serve as key regulatory elements in many critical cellular processes13. However, there are limited tools to study sRNAs and the challenges of detecting sRNA in bacterial cells is due in part to the relatively small size (typically 50-300 nucleotides in length) and low abundance of sRNA molecules as well as the general difficulty in working with smaller biological cells with varying cellular membranes. In this method, we describe fixation and permeabilzation conditions that preserve the structure of bacterial cells and permit the penetration of LNA probes as well as signal amplification steps which enable the specific detection of low abundance sRNA (Figure 2).

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Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

एक उपन्यास उच्च throughput विधि का वर्णन है कि एकल बैक्टीरियल कोशिकाओं से बंद न्यूक्लिक एसिड जांच और प्रवाह cytometry - प्रतिदीप्ति का उपयोग कर छोटे आरएनए और mRNA अभिव्यक्ति के रिश्तेदार quantitation पता लगाने के लिए सक्षम बनाता है<em&gt; बगल में</em&gt; संकरण.

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