Name: locked nucleic acid flow cytometry-fluorescence in situ hybridization (lna flow-fish): a method for bacterial small rna detection
Uploaded: 2012-01-10T13:00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Office of Naval Research via US Naval Research Laboratory kjerne midler.

1. LNA prober og eksperimentell design <ol><li> Design LNA sonder som er det motsatte komplettere din transkribert sRNA / mRNA eller få dem tilpasset designet på <a href="http://www.exiqon.com">www.exiqon.com</a> . Hvis du bruker tilpasset design alternativet, vil du vite sekvensen, men ikke LNA spiking mønster. Tilføyelsen av hver LNA rester inn i en DNA eller RNA oligonukleotid resulterer i en økning i T m på mellom to og 10 ° C for en LNA-RNA hybridisering duplex 14. Ideelt sett bør utformet LNA sondene være mellom 20-25 nukleotider i lengde (lengre prober er vanskeligere å syntetisere) og har en T m på mellom 85-90 ° C for RNA hybridisering. </li><li> Etter utforme sekvensen, bruker BLAST <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> eller sammenligne sonden sekvensen til din lokale database for å sikre sonden gjelder bare for din sRNA / mRNA av interesse. </li><li>Når du bestiller den LNA probe, legge til en biotin-TEG endring i 5 &#39;enden av LNA oligonukleotid. Den biotinylation er nødvendig for post-hybridisering farging med en streptavidin-dye konjugat. Det er mulig å legge denne modifikasjonen til 3 &#39;ende hvis nødvendig, men i tillegg til 5&#39; enden er mindre kostbart og skal resultere i høyere avkastning. </li><li> Tre negative kontroller skal inkluderes i metoden: (i) et &quot;nei LNA &#39;kontroll der en LNA probe ikke er lagt under hybridisering trinnet, (ii) en&#39; no fargestoff kontroll der LNA probe er hybridisert til target sRNA men hybridiseringen arrangementet ikke er oppdaget på grunn av fravær av fluorescerende flekken, og (iii) en &quot;non-uttrykt sRNA / mRNA &#39;kontroll som utnytter en LNA sonde som mål en ikke-eksisterende eller ikke-uttrykt sRNA i orden å overvåke uspesifikk hybridisering. </li><li> De spesifikke LNA probe her er komplementære til sRNA CsrB og har sekvensen 5&#39;-biotin-TEG-gTccAttTccCgtCctTagCagC-3 &#39;(LNA monomerer istore bokstaver). </li><li> Etter mottak av lyofilisert LNA, resuspender med nukleasefritt vann til 50 mg / ml og lagre i 10-20 mL alikvoter ved -20 ° C. </li></ol> Løsninger <ul><li> 8% paraformaldehye (PFA), 10% eddiksyre i PBS: Bland 1 mL 32% PFA, 400 mL eddiksyre, 400 mL 10X PBS, pH = 7.4, og 2.2 mL nukleasefritt vann. For frossen alikvoter, fryse i engangsbruk alikvoter ved -20 ° C uten eddiksyre. </li><li> 60% dekstransulfat: Tilsett 6,0 g dekstransulfat til en 50 mL konisk rør og tilsett vann til en endelig volum på 10 ml. Heat denne blandingen til 65 ° C i vannbad før dekstransulfat er oppløst (kan ta 1-2 timer). Ekstra vann kan trenge å bli lagt gjennom hele solubilization prosessen for å opprettholde en 10 ml volum. Delmengde 60% dekstransulfat løsning og oppbevar ved -20 ° C til bruk. </li></ul> 2. Fiksering <ol><li> Høste 1x10 8 celler av bioluminescent <em&gt; Vibrio campbellii eller bakterier av interesse og overføre dem til en 1,5 mL mikrosentrifuge tube. Dette kvantumet av celler gir nok utgangsmaterialet for fire flow-fiskeprøver (ett bestemt LNA probe prøve og tre negative kontroller). Ekstra 1,5 mL mikrosentrifuge tube alikvoter bør samles dersom andre sRNA / mRNA arter trenger å bli testet. </li><li> Pellet den bakterielle celler ved sentrifugering ved 2300 xg i fem minutter. Kast supernatanten ved pipettering og resuspender cellene i 400 mL av 1X PBS. </li><li> Til denne blandingen, tilsett 400 mL av en 8% paraformaldehye (PFA) og 10% eddiksyre i 1X fosfatbufret saltvann (1X PBS) løsning, bland godt, og inkuber i 10 minutter ved 25 ° C blanding gang etter fem minutter. All inkubasjoner, med mindre annet er angitt, er utført i en oppvarmet tube holderen. Den PFA Løsningen bør være forberedt fersk eller brukt fra frosset alikvoter etter tilsetning av eddiksyre. Paraformaldehyde er en crosslinking fiksativ som helps å bevare cellemorfologi og beholde intracellulære RNA. </li><li> Pellet cellene fra denne blandingen ved sentrifugering ved 4500 xg i to minutter og fjern supernatanten ved pipettering. Alle fremtidige tiltak som krever sentrifugering bør bruke de samme innstillingene (7K, 2 min). Det er viktig å merke seg at etter sentrifugering det supernatants bør fjernes ved pipettering og ikke dekantering. </li><li> Vask cellene to ganger med 400 mL 1X PBS og resuspender den endelige cellepelleten i 400 mL 1X PBS. Cellene er nå løst og kan lagres ved 4 ° C i 400 mL 1X PBS i opptil syv dager. </li></ol> 3. Diethyl pyrocarbonate behandling <ol><li> Forbered 400 mL av en 0,1% løsning av diethyl pyrocarbonate (DEPC) i 1X PBS (400 mL av denne løsningen er nødvendig for hver prøve som skal testes, slik skala tilsvarende). Den DEPC Løsningen bør være forberedt frisk fra en DEPC lager. DEPC behandling inaktiverer RNases av carbethoxylation og minskerbakgrunn signal. </li><li> Legg til 400 mL av 0,1% DEPC løsning til hver faste bakteriell celle prøven og bland godt med pipettering. Inkuber denne blandingen ved 25 ° C i 12 minutter. Vask cellene to ganger med 400 mL 1X PBS, pellet cellene (7K, 2 min) og fjern supernatanten. </li></ol> Fire. Permeabilization <ol><li> Tilsett 1,0 mg av lysozym til 1 ml Tris-EDTA buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 8,0 pH) for en 1,0 mg / ml løsning. Denne løsningen bør være forberedt frisk. Legg til 800 mL av 1 mg / ml lysozym løsning på cellene, blandes grundig ved pipettering og Inkuber ved 25 ° C i 30 minutter med sporadiske blanding. Pellet cellene (7K, 2 min) og fjern supernatanten. Lysozym fungerer som en permeabilization reagens ved hydrolyzing de peptidoglycan stede i bakteriell celle vegger. </li><li> Utarbeide en 3,0 mikrogram / mL løsning av proteinase K i TE buffer. Denne løsningen bør være forberedt frisk fra en 20 mg / ml proteinase K lager som er lagret ved -20 ° C.Proteinase K er en serin protease som fordøyer en rekke proteiner og hjelper tilgjengelighet av sonder og reagenser til RNA. </li><li> Legg til 800 mL av 3,0 mikrogram / mL proteinase K løsning til cellepelleten og blandes grundig ved pipettering. Inkuber ved 25 ° C i 15 minutter med virvling halvveis gjennom inkubering. </li><li> Pellet cellene (7K, 2 min), fjern supernatanten og vask cellene gang med 400 mL 1X PBS. Etter å ha fjernet vaske supernatant, resuspender cellene i 400 mL 1X PBS og tilsett 100 mL av resuspensjon i fire nye 1,5 mL Mikrosentrifugerør. Pellet cellene (7K, 2 min) og fjern supernatanten. </li></ol> 5. Hybridisering <ol><li> Forbered 100 mL av hybridisering buffer (HB) for hver prøve. Den HB består av 50% formamide av volum, 10% dekstransulfat av massen (legg til 16,7 mL av 60% dekstransulfat løsning for hver 100 mL), 1X Denhardt løsning, 50 mM natriumfosfat pH 7,0,2X natriumsitrat (SSC), 20 mikrogram skåret laks sperm DNA (SSSD) og 20 mikrogram gjær tRNA. </li><li> Hver av komponentene i HB har et annet formål. Formamide senker smeltetemperaturen av nukleinsyre tomannsboliger og dermed bidra med denaturering av RNA og minimere celleskader. Dekstransulfat brukes som et volum-eksklusive polymer å konsentrere sonden og øke hybridisering rate. Denhardts løsning, gjær tRNA og SSSD tjene som en blokkerende agenter for å redusere ikke-spesifikk binding. </li><li> I hver av cellen resuspendering inneholder 1,5 ml Mikrosentrifugerør, tilsett 95 mL HB og 5.0 mL av sRNA / mRNA-spesifikke LNA [20 pmol av spesifikke LNA endelig konsentrasjon] eller vann (for ikke LNA negativ kontroll). For eksempel: <ol class="lalpha"><li> Tube 1-95 mL HB + 5,0 mL sRNA / mRNA-spesifikk probe </li><li> Tube 2-95 mL HB + 5,0 mL sRNA / mRNA-spesifikk probe (nei dye &#39;negativ kontroll) </li><li> Tube 3-95 mL HB + 5,0 mL sRNA/ MRNA probe (&#39;non-uttrykt sRNA / mRNA&#39; negativ kontroll) </li><li> Tube 4-95 mL HB + 5,0 mL vann (nei LNA &#39;negativ kontroll) </li></ol></li></ol><ol start="4"><li> Inkuber alle fire prøvene ved 60 ° C i 60 minutter. Den hybridisering Temperaturen avhenger LNA probe (s) T m og bør være innstilt på ca 30 ° C under spådd T m for RNA annealing. Både forhøyet hybridiseringen temperatur og formamide i HB sikrer denaturering av sekundær struktur sRNA eller mRNA av interesse. </li></ol> Seks. Post-hybridisering vasker <ol><li> Etter hybridisering, tilsett 1,0 mL 0.1X SSC med 0,1% Tween-20 (SSCT) til hybridisering blandingen. Dette er nødvendig for at cellene skal fjernes fra den tyktflytende hybridisering løsningen. Pellet cellene (7K, 2 min) og fjern supernatanten. </li><li> Tilsett 200 mL av 50% formamide, 2X SSC, 0,1% Tween-20 til cellen pellets, bland godt og incubspiste i 30 minutter ved 65 ° C i en oppvarming blokk. </li><li> Tilsett 1 mL 0.1X SSCT til blandingen, pellet cellene (7K, 2 min) og fjern supernatanten. </li><li> Legg til 500 mL 0.1X SSCT til resuspender cellene og inkuberes i 40 minutter ved 65 ° C i en varme blokk. Pellet cellene (7K, 2 min) og fjern supernatanten. </li></ol> 7. Blokkering og flekker <ol><li> Klargjør blokkering buffer (BB) og streptavidin-dye flekker løsning. Klargjør en 1X BB løsning fra en 5X lager (kommersielt tilgjengelig, se Reagenser). For hvert sett av fire rør, forberede 1,2 ml 1X BB. </li><li> Tilsett 200 mL 1X BB til cellen pellets, resuspender og inkuberes i 30 minutter ved 25 ° C. </li><li> En streptavidin-konjugert fargestoff brukes til å oppdage biotinylert LNA sonder. Mens blokkering, utarbeide en løsning på 2 mikrogram / mL DyLight 488 streptavidin eller ønsket dye-streptavidin konjugat i 1X BB i 30 min (for tre prøver, gjør 300 mL). </li><li> Etter incubasjon med 1X BB, pellet cellene (7K, 2 min) og fjern supernatanten. Tilsett 50 mL av streptavidin-dye løsning til cellen pellets, bland godt, og inkuberes i 12 minutter ved 25 ° C med konstant blanding på en vortex eller i en thermomixer. For &quot;no fargestoff &#39;kontroll, tilsett 50 mL 1X-blokkering buffer bare. For resten av protokollen, beskytte rørene mot lys med aluminiumsfolie. </li><li> Vask cellene gang med 500 mL 0.1X SSCT buffer og en gang med 400 mL 1X PBS med 0,1% Tween-20 (PBST). Pellet cellene (7K, 2 min) og fjern supernatanten. </li><li> Etter den innledende streptavidin-konjugat flekker, er signalet forsterkes ved å innføre en biotinylert anti-streptavidin antistoff til streptavidin-dye konjugat og deretter beising en gang med streptavidin-dye dermed øke utgangssignal per hybridisert LNA probe (Figur 2) . </li><li> Tilsett 100 mL av 1 mikrogram / mL biotinylert anti-streptavidin antistoff i 1X PBS, resuspend cellene, og Inkuber ved 25 ° C i 30 minutter med sporadiske blanding. Pellet cellene (7K, 2 min), fjern supernatanten og vask to ganger med 400 mL 1X PBST. </li><li> Tilsett 50 mL av de 2 mikrogram / mL streptavidin-dye løsning til cellene, bland godt, og inkuberes i 12 minutter ved 25 ° C med konstant blanding på en vortex eller i en thermomixer. For &quot;no fargestoff &#39;kontroll, tilsett 50 mL 1X-blokkering buffer bare. </li><li> Vask cellene gang med 500 mL 0.1X SSCT buffer og en gang med 400 mL 1X PBST. </li><li> Suspender cellene i 200 mL 1X PBST og oppbevar ved 4 ° C til den er klar for flowcytometri analyse. For mindre bakterieceller sette strømningshastighet å bremse for å redusere kjernen størrelse. I tillegg, for flowcytometere med forover scatter terskel tidsavgrensninger, må cutoff settes så lavt som mulig for å sikre små bakterielle celler oppdages. </li><li> For DyLight 488 deteksjon, bør flowcytometer være utstyrt med en 488 nm laser og standard utslippfiltre for FITC. Minst 2x10 4 hendelser bør samles. For kompatibilitet med flowcytometere utstyrt med forskjellige lasere, kan andre streptavidin-konjugert fluorophores brukes til denne protokollen. </li></ol> 8. Representative resultater Et eksempel på celler som er faste og permeabilized effektivt er vist i flowcytometri dot plottet i Figur 3A. Ved bruk av forholdene beskrevet ovenfor for permeabilization, er cellen befolkningen små og homogen indikerer få celle aggregater. Når høyere (5 mg / ml) konsentrasjoner av lysozyme brukes, cellene er mer sannsynlig å aggregere og viser økt frem scatter verdier indikerer større partikler (Figur 3B). Et eksempel på flowcytometri data fra en vellykket LNA flow-FISH forsøket er vist i Figur 4. Histogrammet viser spesifikk påvisning av et mål sRNA sammen med tre negative kontroller.&quot;No dye &#39;negativ kontroll produserer minst fluorescens, etterfulgt av&quot; no LNA&#39; og &#39;ikke-uttrykte sRNA&#39; negative kontroller. Endelig produserer prøven med sRNA-spesifikke LNA probe størst fluorescens. Når metoden og LNA prober er validert på denne måten, kan flere eksperimenter være konstruert for å overvåke endringer i sRNA signalet over tid, som svar på mutasjoner eller variert kultur forhold, etc. <img alt="Figur 1." src="/files/ftp_upload/3655/3655fig1.jpg" /> Figur 1. Visning av den generelle ordningen med en LNA flow-FISH eksperiment for påvisning av bakteriell sRNA. <img alt="Figur 2." src="/files/ftp_upload/3655/3655fig2.jpg" /> Figur 2. Farging og forsterkning av LNA flow-FISH signal. a) Hybridisering av biotinylert LNA probe. b) Farging med fluorescerende DyLight 488 streptavidin konjugat. c) Binding av biotinylert anti-streptavidin antistoff til DyLight 488 streptavidin. Antistoffet kan binde streptavidin gjennom sin antigen-bindende område eller kan være bundet av streptavidin gjennom sin biotin rester. d) forsterkning av signalet ved ytterligere farging med den fluorescerende DyLight 488 streptavidin konjugat. <img alt="Figur 3." src="/files/ftp_upload/3655/3655fig3.jpg" /> Figur 3. Flow cytometri dot tomter viser frem versus side scatter resultater for a) 1 mg / ml lysozyme, 3 mikrogram / ​​mL proteinase K permeabilization og b) 5 mg / ml lysozyme, 3 mikrogram / ​​ml proteinase K permeabilization. <img alt="Figur 4." src="/files/ftp_upload/3655/3655fig4.jpg" /> Figur 4. Histogram analyse av LNA flow-FISH resultatene. Den fluorescerende signal genereres fra hver prøve er vist ved de fire spor: svart - sRNA-spesifikke LNA probe; rød - &quot;ikke-uttrykte sRNA &#39;negativ kontroll, blå - nei LNA&#39; negativ kontroll; lilla -&#39;No fargestoff &quot;negativ kontroll.

<ol>
	<li>Rufer, N., Dragowska, W., Thornbury, G., Roosnek, E., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+length+dynamics+in+human+lymphocyte+subpopulations+measured+by+flow+cytometry.">Telomere length dynamics in human lymphocyte subpopulations measured by flow cytometry.</a> Nat. Biotechnol. 16, 743-747 (1998).</li><li>Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+telomere+length+of+human+chromosomes.">Heterogeneity in telomere length of human chromosomes.</a> Hum. Mol. Genet. 5, 685-691 (1996).</li><li>Pernthaler, A., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Fluorescence+In+Situ+Hybridization+of+mRNA+and+rRNA+in+Environmental+Bacteria.">Simultaneous Fluorescence In Situ Hybridization of mRNA and rRNA in Environmental Bacteria.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 5426-5433 (2004).</li><li>Jen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-FISH+analysis+and+isolation+of+clostridial+strains+in+an+anaerobic+semi-solid+bio-hydrogen+producing+system+by+hydrogenase+gene+target.">Flow-FISH analysis and isolation of clostridial strains in an anaerobic semi-solid bio-hydrogen producing system by hydrogenase gene target.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 74, 1126-1134 (2007).</li><li>Robertson, K. L., Verhoeven, A. B., Thach, D., Chang, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Viral+RNA+in+Infected+Cells+with+LNA+Flow-FISH.">Monitoring Viral RNA in Infected Cells with LNA Flow-FISH.</a> RNA. 16, 1679-1685 (2010).</li><li>Friedrich, U., Lenke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Enumeration+of+Lactic+Acid+Bacteria+in+Mesophilic+Dairy+Starter+Cultures+by+Using+Multiplex+Quantitative+Real-Time+PCR+and+Flow+Cytometry-Fluorescence+In+Situ+Hybridization.">Improved Enumeration of Lactic Acid Bacteria in Mesophilic Dairy Starter Cultures by Using Multiplex Quantitative Real-Time PCR and Flow Cytometry-Fluorescence In Situ Hybridization.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 4163-4171 (2006).</li><li>Thomsen, R., Nielsen, P. S., Jensen, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatically+improved+RNA+in+situ+hybridization+signals+using+LNA-modified+probes.">Dramatically improved RNA in situ hybridization signals using LNA-modified probes.</a> RNA. 11, 1745-1748 (2005).</li><li>Silahtaroglu, A. N., Tommerup, N., Vissing, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISHing+with+locked+nucleic+acids+(LNA):+evaulation+of+different+LNA/DNA+mixmers.">FISHing with locked nucleic acids (LNA): evaulation of different LNA/DNA mixmers.</a> Mol. Cell. Probes. 17, 165-169 (2003).</li><li>Obika, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2'-O,+4'-C-methyleneuridine+and+-cytidine.+Novel+bicyclic+nucleosides+having+a+fixed+C3'-endo+sugar+puckering.">Synthesis of 2'-O, 4'-C-methyleneuridine and -cytidine. Novel bicyclic nucleosides having a fixed C3'-endo sugar puckering.</a> Tetrahedron. Lett. 38, 8735-8738 (1997).</li><li>Koshkin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LNA+(locked+nucleic+acids):+synthesis+of+the+adenine,+cytosine,+guanine,+5-methylcytosine,+thymine,+and+uracil+bicyclonucleoside+monomers+oligomerisation,+and+unprecedented+nucleic+acid+recognition.">LNA (locked nucleic acids): synthesis of the adenine, cytosine, guanine, 5-methylcytosine, thymine, and uracil bicyclonucleoside monomers oligomerisation, and unprecedented nucleic acid recognition.</a> Tetrahedron. 54, 3607-3630 (1998).</li><li>Kubota, K., Ohashi, A., Imachi, H., Harada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+in+situ+hybridization+efficiency+with+locked-nucleic-acid-incorporated+DNA+probes.">Improved in situ hybridization efficiency with locked-nucleic-acid-incorporated DNA probes.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 5311-5317 (2006).</li><li>Robertson, K. L., Thach, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LNA+flow-FISH:+A+flow+cytometry-fluorescence+in+situ+hybridization+method+to+detect+messenger+RNA+using+locked+nucleic+acid+probes.">LNA flow-FISH: A flow cytometry-fluorescence in situ hybridization method to detect messenger RNA using locked nucleic acid probes.</a> Anal. Biochem. 390, 109-114 (2009).</li><li>Waters, L., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+RNAs+in+bacteria.">Regulatory RNAs in bacteria.</a> Cell. 136, 615-628 (2009).</li><li>Petersen, M., Wengel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LNA:+a+versatile+tool+for+therapeutics+and+genomics.">LNA: a versatile tool for therapeutics and genomics.</a> Trends. Biotechnol. 21, 74-81 (2003).</li><li>Corput, M. P. C. v. d., Grosveld, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+Situ+Hybridization+Analysis+of+Transcript+Dynamics+in+Cells.">Fluorescence in Situ Hybridization Analysis of Transcript Dynamics in Cells.</a> Methods. 25, 111-118 (2001).</li><li>Silveira, A. C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+non-coding+RNAs+in+environmental+vibrios.">Identification of non-coding RNAs in environmental vibrios.</a> Microbiology. 156, 2452-2458 (2010).</li></ol>

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Den LNA flow-FISH metoden som presenteres her ble brukt til å oppdage uttrykk for en sRNA fra Gram-negative marine bakterien Vibrio campbellii hvis uttrykket har tidligere vært bekreftet via microarray-baserte uttrykket profilering og revers transkripsjon polymerase kjedereaksjon 16. Hittil har vi brukt denne metoden til å overvåke uttrykk for et utvalg av RNA (f.eks trans-kodet sRNA, sRNA som modulerer protein aktivitet, riboswitches, og mRNA). Som sådan, er vi sikre på at metoden er fleksibel og kan brukes til å oppdage eventuelle sRNA eller mRNA målet og kan bli endret for bruk i alle bakterielle arter eller celletype. Hvis endringer i denne protokollen er nødvendig for andre celletyper, er den viktigste variabelen for å vurdere manipulere permeabilization trinn. For eksempel når du endrer permeabilization forholdene beskrevet her, bør endringer i konsentrasjonene av lysozym og proteinase K prøves. Vi fant at en dobling ellertredoble mengden av lysozym og proteinase K resulterte i store endringer i LNA flow-FISH resultatene. Videre, når testing ekstra permeabilization forhold, bør cellene bli analysert for klumper, celle tap, og den best oppnåelige signal til bakgrunnsfluorescens ratio. Omfanget av celle klumper kan testes for ved mikroskopi og / eller flowcytometri. Ved flowcytometri, celle klumper er til stede som haler i en fremskutt vs side scatter dot plottet og riktig permeabilization metoden vil redusere denne tailing effekt. Denne metoden er også mottagelig for multiplex sRNA deteksjon uten store modifikasjoner til den beskrevne protokoll som ytterligere LNA prober merket med andre haptens som digoxigenin kunne legges under hybridiseringen trinnet og deretter oppdaget med en anti-digoxigenin antistoff og sekundære antistoff-fluoroforen konjugat. Foreløpig er den eneste begrensningen vi har støtt på med denne metoden sin manglende evne til å generere tilstrekkelig signal fra svakt extrykket sRNA arter og arbeid er i gang for å bestemme deteksjonsgrensen (i absolutte eksemplar nummer per celle). Samlet gir LNA flow-FISH metoden mulighet til å måle bakteriell sRNA eller mRNA uttrykk ved én celle-nivå i en høy gjennomstrømning måte å gi innsikt om tilstedeværelse og relative overflod av en sRNA arter og i hvilken grad dens uttrykk varierer i en populasjon.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagens </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> 10X Fosfatbufret saltvann (PBS), pH 7,4 </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9625 </td><td></td></tr><tr><td> Nukleasefritt vann </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9932 </td><td> (Ikke DEPC behandlet) </td></tr><tr><td> 32% Paraformaldehyde </td><td> Elektronmikroskopi Sciences </td><td> RT 15714 </td><td> Etanol gratis </td></tr><tr><td> Eddiksyre </td><td> Acros Organics </td><td> 327290010 </td><td></td></tr><tr><td> Diethyl pyrocarbonate (DEPC) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D5758 </td><td&gt; Hold desiccated </td></tr><tr><td> Lysozym </td><td> Sigma Aldrich </td><td> L2879 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K (20 mg / ml) </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM2546 </td><td></td></tr><tr><td> Formamide </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9342 </td><td> Avionisert, alikvoter og fryse </td></tr><tr><td> Dekstransulfat MW&gt; 500000 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D8906 </td><td> Delmengde 60% løsning og fryse </td></tr><tr><td> Denhardt løsning 50X konsentrere </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D2532 </td><td> Delmengde og fryse </td></tr><tr><td> Natriumsitrat buffer 20X </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9770 </td><td></td></tr><tr> &lt;td&gt; Laks sperm DNA (skåret) 10 mg / ml </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9680 </td><td> Delmengde og fryse </td></tr><tr><td> Gjær tRNA (10 mg / ml) </td><td> Livet Technologies / Invitrogen </td><td> 15401-011 </td><td> Delmengde og fryse </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> 5X in situ hybridisering blokkering løsning </td><td> Vector Laboratories </td><td> MB-1220 </td><td></td></tr><tr><td> DyLight 488 streptavidin </td><td> Vector Laboratories </td><td> SA-5488-1 </td><td></td></tr><tr><td> Biotinylert anti-streptavidin </td><td> Vector Laboratories </td><td> BA-0500 </td><td> Delmengde og fryse </td></tr></tbody></table>

locked nucleic acid flow cytometry-fluorescence in situ hybridization (lna flow-fish): a method for bacterial small rna detection

Fluorescens in situ hybridisering (FISH) er en kraftfull teknikk som brukes til å oppdage og lokalisere spesifikke nukleinsyre sekvenser i den cellulære miljøet. For å øke gjennomstrømning, kan FISH kombineres med flowcytometri (flow-FISH) for å aktivere sporing av målrettede nukleinsyre sekvenser i tusenvis av individuelle celler. Som et resultat, tilbyr flow-FISH en klar fordel over lysate / ensemble-baserte nukleinsyre deteksjonsmetoder fordi hver celle er behandlet som en uavhengig observasjon, og dermed tillater sterkere statistisk og varians analyser. Disse attributtene har bedt om bruken av fisk og flow-FISH metoder i en rekke forskjellige applikasjoner og nytten av disse metodene har blitt demonstrert i telomere lengde besluttsomhet 1,2, cellular identifisering og genekspresjon 3,4, overvåking viral multiplikasjon i infiserte celler 5, og bakteriell community analyse og tellingSeks. Tradisjonelt har spesifisitet av fisk og flow-FISH metoder blitt formidles av DNA oligonukleotid sonder. Nylig har imidlertid utskifting av DNA oligonukleotid prober med nukleinsyre analogs som FISH og flow-FISH probes økt både sensitivitet og spesifisitet av hver teknikk på grunn av høyere smeltepunkt temperaturer (T m) av disse analogs for naturlige nukleinsyrer 7,8 . Låste nukleinsyre (LNA) prober er en type nukleinsyre analog som inneholder LNA nukleotidene spiked gjennom en DNA eller RNA sekvensen 9,10. Når dette kombineres med flow-FISH har LNA prober tidligere vist seg å utkonkurrere konvensjonelle DNA prober 7,11 og har blitt brukt til å oppdage eukaryot mRNA 12 og viral RNA i mammalske celler 5. Her vil vi utvide dette evne og beskriver en LNA flow-FISH metoden som tillater spesifikk påvisning av RNA i bakterie celles (Figur 1). Spesielt er vi interessert i å påvise små ikke-kodende regulatoriske RNA (sRNA) som har fått stor interesse i de siste årene som de har vist seg å fungere som sentrale regulatoriske elementer i mange kritiske cellulære prosesser 13. Det er imidlertid begrenset verktøy for å studere sRNAs og utfordringene knyttet til å påvise sRNA i bakterieceller skyldes delvis den relativt lille størrelsen (typisk 50-300 nukleotidene i lengde) og lav overflod av sRNA molekyler samt generelle vansker i arbeidslivet med mindre biologiske celler med varierende cellulære membraner. I denne metoden beskriver vi fiksering og permeabilzation forhold som bevare strukturen i bakterieceller og tillate inntrengning av LNA prober samt signal forsterkning tiltak som gjør det mulig spesifikk påvisning av lav overflod sRNA (figur 2).

Watch this Scientific Journal Video about Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection at JoVE.com

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

En roman high-throughput metoden er beskrevet som muliggjør deteksjon og relativ kvantifisering av små RNA og mRNA uttrykk fra enkeltrom bakterieceller bruker låst nukleinsyre prober og flowcytometri-fluorescens<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering.

Stengte Nucleic Acid flowcytometrisystemer-fluorescens In situ Hybridisering (LNA flow-FISH): En metode for Bakteriell små RNA Detection

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Transfection and Mutagenesis of Target Genes in Mosquito Cells by Locked Nucleic Acid-modified Oligonucleotides

Plasmodium parasites, the causative agent of malaria, are transmitted through the bites of infected Anopheles mosquitoes resulting in over 250 million new ...

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Hybridisering<em&gt; In situ</em&gt; Av spyttkjertler, eggstokker, og embryo av Vector Mygg

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluoriserende<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering på mitotiske kromosomer Mygg

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Bakteriell kunstige kromosomer: En funksjonell genom Tool for studier av Positive-strand RNA virus

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

Rask, sikker og enkel manuell sengen nukleinsyre utvinning for påvisning av Virus i hele blodprøver

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Kvantitative fluorescens in situ hybridisering (FISH) og Immunofluorescence (IF) av spesifikke Gene Products i KSHV-infiserte celler

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

Modeling Hepatitis B Virus Infection in Non-Hepatic 293T-NE-3NRs Cells

Modellering hepatitt B Virus infeksjon i ikke-hepatisk 293T-NE-3NRs celler

HBV mainly infects human hepatocytes, but it has also been found to infect extrahepatic tissues such as kidney and testis. Nonetheless, cell-based HBV ...

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

En ikke-kodende liten RNA-micC bidrar til virulens i ytre membranproteiner i Salmonella enteritidis

A non-coding small RNA (sRNA) is a new factor to regulate gene expression at the post-transcriptional level. A kind of sRNA MicC, known in Escherichia ...