Name: locked nucleic acid flow cytometry-fluorescence in situ hybridization (lna flow-fish): a method for bacterial small rna detection
Uploaded: 2012-01-10T13:00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection at JoVE.com

Эта работа была поддержана Управлением военно-морских исследований ВМС США с помощью средств научно-исследовательской лаборатории ядра.

<ol>
	<li>Rufer, N., Dragowska, W., Thornbury, G., Roosnek, E., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+length+dynamics+in+human+lymphocyte+subpopulations+measured+by+flow+cytometry.">Telomere length dynamics in human lymphocyte subpopulations measured by flow cytometry.</a> Nat. Biotechnol. 16, 743-747 (1998).</li><li>Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+telomere+length+of+human+chromosomes.">Heterogeneity in telomere length of human chromosomes.</a> Hum. Mol. Genet. 5, 685-691 (1996).</li><li>Pernthaler, A., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Fluorescence+In+Situ+Hybridization+of+mRNA+and+rRNA+in+Environmental+Bacteria.">Simultaneous Fluorescence In Situ Hybridization of mRNA and rRNA in Environmental Bacteria.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 5426-5433 (2004).</li><li>Jen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-FISH+analysis+and+isolation+of+clostridial+strains+in+an+anaerobic+semi-solid+bio-hydrogen+producing+system+by+hydrogenase+gene+target.">Flow-FISH analysis and isolation of clostridial strains in an anaerobic semi-solid bio-hydrogen producing system by hydrogenase gene target.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 74, 1126-1134 (2007).</li><li>Robertson, K. L., Verhoeven, A. B., Thach, D., Chang, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Viral+RNA+in+Infected+Cells+with+LNA+Flow-FISH.">Monitoring Viral RNA in Infected Cells with LNA Flow-FISH.</a> RNA. 16, 1679-1685 (2010).</li><li>Friedrich, U., Lenke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Enumeration+of+Lactic+Acid+Bacteria+in+Mesophilic+Dairy+Starter+Cultures+by+Using+Multiplex+Quantitative+Real-Time+PCR+and+Flow+Cytometry-Fluorescence+In+Situ+Hybridization.">Improved Enumeration of Lactic Acid Bacteria in Mesophilic Dairy Starter Cultures by Using Multiplex Quantitative Real-Time PCR and Flow Cytometry-Fluorescence In Situ Hybridization.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 4163-4171 (2006).</li><li>Thomsen, R., Nielsen, P. S., Jensen, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatically+improved+RNA+in+situ+hybridization+signals+using+LNA-modified+probes.">Dramatically improved RNA in situ hybridization signals using LNA-modified probes.</a> RNA. 11, 1745-1748 (2005).</li><li>Silahtaroglu, A. N., Tommerup, N., Vissing, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISHing+with+locked+nucleic+acids+(LNA):+evaulation+of+different+LNA/DNA+mixmers.">FISHing with locked nucleic acids (LNA): evaulation of different LNA/DNA mixmers.</a> Mol. Cell. Probes. 17, 165-169 (2003).</li><li>Obika, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2'-O,+4'-C-methyleneuridine+and+-cytidine.+Novel+bicyclic+nucleosides+having+a+fixed+C3'-endo+sugar+puckering.">Synthesis of 2'-O, 4'-C-methyleneuridine and -cytidine. Novel bicyclic nucleosides having a fixed C3'-endo sugar puckering.</a> Tetrahedron. Lett. 38, 8735-8738 (1997).</li><li>Koshkin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LNA+(locked+nucleic+acids):+synthesis+of+the+adenine,+cytosine,+guanine,+5-methylcytosine,+thymine,+and+uracil+bicyclonucleoside+monomers+oligomerisation,+and+unprecedented+nucleic+acid+recognition.">LNA (locked nucleic acids): synthesis of the adenine, cytosine, guanine, 5-methylcytosine, thymine, and uracil bicyclonucleoside monomers oligomerisation, and unprecedented nucleic acid recognition.</a> Tetrahedron. 54, 3607-3630 (1998).</li><li>Kubota, K., Ohashi, A., Imachi, H., Harada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+in+situ+hybridization+efficiency+with+locked-nucleic-acid-incorporated+DNA+probes.">Improved in situ hybridization efficiency with locked-nucleic-acid-incorporated DNA probes.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 5311-5317 (2006).</li><li>Robertson, K. L., Thach, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LNA+flow-FISH:+A+flow+cytometry-fluorescence+in+situ+hybridization+method+to+detect+messenger+RNA+using+locked+nucleic+acid+probes.">LNA flow-FISH: A flow cytometry-fluorescence in situ hybridization method to detect messenger RNA using locked nucleic acid probes.</a> Anal. Biochem. 390, 109-114 (2009).</li><li>Waters, L., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+RNAs+in+bacteria.">Regulatory RNAs in bacteria.</a> Cell. 136, 615-628 (2009).</li><li>Petersen, M., Wengel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LNA:+a+versatile+tool+for+therapeutics+and+genomics.">LNA: a versatile tool for therapeutics and genomics.</a> Trends. Biotechnol. 21, 74-81 (2003).</li><li>Corput, M. P. C. v. d., Grosveld, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+Situ+Hybridization+Analysis+of+Transcript+Dynamics+in+Cells.">Fluorescence in Situ Hybridization Analysis of Transcript Dynamics in Cells.</a> Methods. 25, 111-118 (2001).</li><li>Silveira, A. C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+non-coding+RNAs+in+environmental+vibrios.">Identification of non-coding RNAs in environmental vibrios.</a> Microbiology. 156, 2452-2458 (2010).</li></ol>

Авторы не имеют ничего раскрывать.

МШУ поток-FISH метод, представленный здесь был использован для обнаружения выражение р-РНК из грамотрицательные бактерии Vibrio морских campbellii экспрессии которых ранее было подтверждено с помощью микрочипов основе профилирования экспрессии и обратной транскрипции полимеразной цепной реакции 16. На сегодняшний день мы использовали этот метод для контроля экспрессии различных РНК (например, транс-закодированных Срна, р-РНК, которые модулируют активность белка, riboswitches, и мРНК). Таким образом, мы уверены, что метод является гибкой и может быть использован для обнаружения любых р-РНК, или мРНК цели и могут быть модифицированы для использования в любых видов бактерий или типа клеток. Если модификации этого протокола необходимо для других типов клеток, наиболее важной переменной для рассмотрения манипулирования является пермеабилизации шаг. Например, при изменении пермеабилизации условиях, описанных здесь, изменения в концентрации лизоцима и протеиназы К должны быть проверены. Мы обнаружили, что удвоение илиутроить количество лизоцима и протеиназы К привело к существенным изменениям в потоке МШУ-FISH результаты. Кроме того, при проверке дополнительных условий пермеабилизации, клетки должны быть проанализированы на слипания, потерю клеток, а также получить лучший сигнал фоновой флуоресценции отношение. Степени клеточной слипания могут быть проверены на микроскопией и / или проточной цитометрии. По проточной цитометрии, сотовые сгустки присутствуют в виде хвостов вперед по сравнению стороне диаграммы разброса точек и правильного метода пермеабилизации позволит свести к минимуму это воздействие хвостохранилища. Этот метод также поддается мультиплекс р-РНК обнаружения без существенных изменений в протоколе описаны как дополнительные зонды МШУ помечены других гаптенов, таких как дигоксигенин могут быть добавлены в процессе гибридизации шаг, а затем обнаружить анти-дигоксигенин антитела и вторичные антитела флуорофора сопряжены. В настоящее время единственным ограничением, что мы столкнулись с помощью этого метода является его неспособность генерировать достаточный сигнал от слабо бывшихнажата р-РНК видов и предпринимаются усилия, чтобы определить порог обнаружения (в абсолютных числа копий на клетку). В целом, МШУ поток-FISH метод дает возможность измерять бактериальной или р-РНК экспрессию мРНК на одном уровне ячейки в высокой пропускной образом, чтобы дать представление о присутствии и относительное обилие видов Срна и степень, в которой ее выражения меняется в популяции.

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td> 10 раз фосфатным буферным раствором (PBS), рН 7,4 </td><td> Applied Biosystems / Амбион </td><td> AM9625 </td><td></td></tr><tr><td> Нуклеазы без воды </td><td> Applied Biosystems / Амбион </td><td> AM9932 </td><td> (Не DEPC лечение) </td></tr><tr><td> 32% параформальдегида </td><td> Электронная микроскопия наук </td><td> RT 15714 </td><td> Этанол свободный </td></tr><tr><td> Уксусная кислота </td><td> Acros Organics </td><td> 327290010 </td><td></td></tr><tr><td> Диэтиловый pyrocarbonate (DEPC) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D5758 </td><tй&gt; Хранить высушенный </td></tr><tr><td> Лизоцим </td><td> Sigma Aldrich </td><td> L2879 </td><td></td></tr><tr><td> Протеиназы К (20 мг / мл) </td><td> Applied Biosystems / Амбион </td><td> AM2546 </td><td></td></tr><tr><td> Формамид </td><td> Applied Biosystems / Амбион </td><td> AM9342 </td><td> Деионизированная, Алиготе и заморозить </td></tr><tr><td> Декстран сульфата МВт&gt; 500000 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D8906 </td><td> Алиготе 60%-ный раствор и заморозить </td></tr><tr><td> Решение Денхардта 50X концентрат </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D2532 </td><td> Алиготе и заморозить </td></tr><tr><td> Цитрат натрия буфера 20X </td><td> Applied Biosystems / Амбион </td><td> AM9770 </td><td></td></tr><tr> &lt;TD&gt; ДНК спермы лосося (стриженый) 10 мг / мл </td><td> Applied Biosystems / Амбион </td><td> AM9680 </td><td> Алиготе и заморозить </td></tr><tr><td> Дрожжи тРНК (10 мг / мл) </td><td> Life Technologies / Invitrogen </td><td> 15401-011 </td><td> Алиготе и заморозить </td></tr><tr><td> Твин-20 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> 5 раз в гибридизация блокирующий раствор </td><td> Vector Laboratories </td><td> MB-1220 </td><td></td></tr><tr><td> DyLight 488 стрептавидин </td><td> Vector Laboratories </td><td> SA-5488-1 </td><td></td></tr><tr><td> Биотинилированные анти-стрептавидин </td><td> Vector Laboratories </td><td> BA-0500 </td><td> Алиготе и заморозить </td></tr></tbody></table>

locked nucleic acid flow cytometry-fluorescence in situ hybridization (lna flow-fish): a method for bacterial small rna detection

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular environment. In order to increase throughput, FISH can be combined with flow cytometry (flow-FISH) to enable the detection of targeted nucleic acid sequences in thousands of individual cells. As a result, flow-FISH offers a distinct advantage over lysate/ensemble-based nucleic acid detection methods because each cell is treated as an independent observation, thereby permitting stronger statistical and variance analyses. These attributes have prompted the use of FISH and flow-FISH methods in a number of different applications and the utility of these methods has been successfully demonstrated in telomere length determination1,2, cellular identification and gene expression3,4, monitoring viral multiplication in infected cells5, and bacterial community analysis and enumeration6.
Traditionally, the specificity of FISH and flow-FISH methods has been imparted by DNA oligonucleotide probes. Recently however, the replacement of DNA oligonucleotide probes with nucleic acid analogs as FISH and flow-FISH probes has increased both the sensitivity and specificity of each technique due to the higher melting temperatures (Tm) of these analogs for natural nucleic acids7,8. Locked nucleic acid (LNA) probes are a type of nucleic acid analog that contain LNA nucleotides spiked throughout a DNA or RNA sequence9,10. When coupled with flow-FISH, LNA probes have previously been shown to outperform conventional DNA probes7,11 and have been successfully used to detect eukaryotic mRNA12 and viral RNA in mammalian cells5.
Here we expand this capability and describe a LNA flow-FISH method which permits the specific detection of RNA in bacterial cells (Figure 1). Specifically, we are interested in the detection of small non-coding regulatory RNA (sRNA) which have garnered considerable interest in the past few years as they have been found to serve as key regulatory elements in many critical cellular processes13. However, there are limited tools to study sRNAs and the challenges of detecting sRNA in bacterial cells is due in part to the relatively small size (typically 50-300 nucleotides in length) and low abundance of sRNA molecules as well as the general difficulty in working with smaller biological cells with varying cellular membranes. In this method, we describe fixation and permeabilzation conditions that preserve the structure of bacterial cells and permit the penetration of LNA probes as well as signal amplification steps which enable the specific detection of low abundance sRNA (Figure 2).

Watch this Scientific Journal Video about Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection at JoVE.com

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

Роман высокой пропускной описан метод, который позволяет обнаружение и относительной количественного малых РНК и экспрессию мРНК из одного бактериальных клеток с использованием заблокирован нуклеиновых кислот зондов и проточной цитометрии флуоресценции<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизации.

Закрытые нуклеиновых кислот цитометрии потока флуоресценции На месте Гибридизация (LNA поток-FISH): Метод бактериального Малый обнаружения РНК

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Сочетание Клей-ленты на основе выборки и флуоресценции На месте Гибридизация для быстрого обнаружения Сальмонеллы На Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Transfection and Mutagenesis of Target Genes in Mosquito Cells by Locked Nucleic Acid-modified Oligonucleotides

Трансфекция и мутагенеза генов-мишеней в Mosquito ячейки путем Закрытые нуклеиновых кислот модифицированных олигонуклеотидов

Plasmodium parasites, the causative agent of malaria, are transmitted through the bites of infected Anopheles mosquitoes resulting in over 250 million new ...

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

&quot;Биолюминесцентный &#39;Reporter Фаг для обнаружения Категория бактериальных патогенов

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Гибридизация<em&gt; На месте</em&gt; Слюнных желез, яичников, а также эмбрионы комаров

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Флуоресцентный<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизации на митотических хромосом от комаров

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Бактериальный искусственные хромосомы: Функциональный геномики инструмент для изучения Положительный нити РНК вирусы

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

Быстрый, безопасный и простой ручной прикроватные нуклеиновой кислоты извлечения для обнаружения вируса в пробах цельной крови

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Количественная флуоресценция в ситу Гибридизации (FISH) и иммунофлуоресценции (ИФ) специфических генных продуктов в KSHV-зараженных клетках

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

Modeling Hepatitis B Virus Infection in Non-Hepatic 293T-NE-3NRs Cells

Моделирование инфекции вируса гепатита В в клетках не хедпатического 293T-NE-3NRs

HBV mainly infects human hepatocytes, but it has also been found to infect extrahepatic tissues such as kidney and testis. Nonetheless, cell-based HBV ...

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

Некодирующая малая РНК MicC способствует вирулентности белков наружной мембраны Salmonella enteritidis

A non-coding small RNA (sRNA) is a new factor to regulate gene expression at the post-transcriptional level. A kind of sRNA MicC, known in Escherichia ...