Name: determining optimal cytotoxic activity of human her2neu specific cd8 t cells by comparing the cr51 release assay to the xcelligence system
Uploaded: 2012-08-08T12:00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud til Keith L. Knutson fra Susan G. Komen for Cure Foundation og NIH / NCI 9R01 CA152045 og P50-CA116201.

1.. Generering af kortsigtede menneskelige Antigen-specifikke CD8 T-cellelinjer 7 <ol><li> Separate perifere mononukleare blodceller (PBMC&#39;er) fra blodet af normale raske HLA-A2 positive donorer ved hjælp af Ficoll-Paque Plus. </li><li> Der tilsættes 2 ml / brønd af PBMC&#39;er til plader med 6 brønde ved 2 x 10 6 celler / ml. </li><li> Tilføj HLA-A2-bindende HER-2/neu p369-377 peptid (aminosyresekvens KIFGSLAFL) eller HLA-A2-bindende influenza P58-66-peptid (GILGFVFTL) direkte til brøndene i en endelig koncentration på 10 ug / ml og sted i en inkubator ved 37 ° C med 5% CO2. </li><li> Til at stimulere og udvide T-celler, tilføje, hver 2 dage, 250 gl / brønd frisk medium suppleret med human rekombinant IL-2 (lager: 50 units / pi) for at opnå en slutkoncentration på 50 enheder / ml i dyrkningsmediet. </li><li> Re-stimulere dyrkningsceller med 2 x 10 6 celler / ml bestrålede autologe PBMC&#39;er pulset i 2 timer med 10 ug / ml af de samme peptider brugerd i trin 1.3 og tilføje disse celler til kulturer ved 1 ml / brønd en uge efter den første peptidstimulering. </li><li> Tilføj humane rekombinante IL-2 og friske medier, som beskrevet i trin 1.4, i de eksisterende kulturer hver 2 dage. </li><li> Re-stimulere cellerne med peptid og bestrålede autologe PBMC&#39;er som beskrevet i trin 1.5 en uge efter den anden peptidstimulering. </li><li> Forbered dig på at bruge celler seks dage efter den sidste re-stimulation tidligst. </li></ol> 2.. Udarbejdelse af brystkræftceller <ol><li> Placer xCelligence impedans målestation (xCelligence station) i en inkubator ved 37 ° C med 5% CO2. </li><li> Harvest humane tumorceller (SKBR3, BT20, MCF7 eller HCC1419), der er 75% sammenflydende anvendelse af 0,25% trypsin og centrifugering (1.000 rpm i 5 minutter). </li><li> Tælle tumorceller ved hjælp af et hæmocytometer og rekonstruere dem i RPMI tumor medier (suppleret med 10% kalvefosterserum (FBS) og 500 enheder / mlIFN-gamma) i en koncentration på 7,5 x 10 3 tumor celler/100 pi. </li><li> Programmer xCelligence software ved at oprette layout siden for at bestemme godt layout og ved at oprette tidsplanen siden at tage impedans målinger hvert 5. minut for en 40 timers periode. For de første 18 timer, vil xCelligence system tager impedans aflæsninger af tumorcellerne alene. </li><li> Tilføj 100 ul RPMI tumor medier til xCelligence E-plader og udføre en baggrund læsning ved at måle impedans i fravær af celler. </li><li> Tilføj tumorceller til E-pladerne ved 100 pi per brønd og plads i xCelligence station. </li><li> Tryk på startknappen på xCelligence software til at begynde at tage impedans læsninger af tumorcellerne, som straks begynder at overholde de E-plader. </li></ol> 3.. Co-kultur af tumor med CD8-T-celler <ol><li> Når tumorcellerne har lagt og fordoblet til 1,5 x 10 4 tumorceller per brønd (caende 18 timer efter oprindeligt at være belagt), tilberedt høst T-celler i afdeling 1 ved forsigtig skrabning og agitation </li><li> Centrifuge ved 1.000 rpm i 5 minutter, og tælle T-celler ved hjælp af et hæmocytometer og rekonstruere dem i RPMI medier med 10% FBS i forskellige forhold, begyndende ved et maksimalt forhold på 1 tumorcelle til 40 T-celler og fortyndes 2 gange indtil et forhold på 1 tumorcelle til 1,25 T-celler er nået. For eksempel er der 1,5 x 10 4 tumorceller per brønd. For at opnå en 01:40-forhold, tilsættes 6 x 10 5 T-celler per brønd og fortyndes T-cellerne 2 gange indtil et forhold på 1,5 x 10 4 tumorceller til 1.875 x 10 4 T-celler per brønd (1:1,25 ratio) opnås. </li><li> Pause i xCelligence station og fjern E-pladen. </li><li> Fjern medierne i brøndene med en pipette og der tilsættes 200 ul af medier alene eller passende forhold mellem T-celler til brøndene. </li><li> Placer E-pladen tilbage i xCelligence station og fortsætte xCelligence software program så impedans aflæsninger tages hver 5 minutter til cirka 20 timer efter T-celle tilsætning. </li><li> Normalisere resultaterne i slutningen af ​​analysen. </li></ol> 4.. Chromfrigivelsesanalyse (CRA) 7 <ol><li> Følg de institutionelle stråling sikkerhedsprocedurer, når de arbejder med 51 Cr og 51 Cr-mærkede målceller. Brug altid passende afskærmning for at reducere stråling. </li><li> Pulse tumorceller i 2 timer ved 1 x 10 6 tumorceller / ml med 10 ul / ml frisk 51Cr (0,005 Ci / ml). </li><li> Vask tumorceller i 10 ml RPMI medier med 10% FBS og centrifugeres ved 1.000 rpm i 5 minutter. Tilføj tumorceller til en 96-brønds rundbundet plade på 1 x 10 5 tumorceller i 100 gl / brønd. </li><li> Tilføj T-celler i forskellige forhold, begyndende fra 1 tumorcelle til 40 T-celler og fortyndes 2 gange indtil et forhold på 1 tumorcelle til 1,25 T-celler er opnået. For eksempel er der 1 x 10 5 tumorceller<html> brønd. For at opnå en 01:40-forhold, tilsættes 4 x 10 6 T-celler per brønd og fortyndes T-cellerne 2 gange indtil et forhold på 1 x 10 5 tumorceller til 1,25 x 10 5 T-celler per brønd (1:1,25 ratio) opnås. </li><li> Tilføj spontane og maksimal tumorcellelinier kontrolelementer til pladen. For at beregne den spontane frigivelse af 51Cr fra tumorcellerne, tilføje seks brønde hver indeholder 1 x 10 5 tumorceller i 100 pi til 100 ul RPMI medier med 10% FBS. At beregne det maksimale frigivelse af 51Cr fra tumorcellerne, tilføje seks brønde hver indeholder 1 x 10 5 tumorceller i 100 pi til 100 gl 0,1% Triton X-100 i PBS, der lyserer alle celler. </li><li> Pladerne inkuberes i 5 timer ved 37 ° C med 5% CO2. </li><li> Efter inkubation fjernes 50 pi af supernatanten fra hver brønd og føje det til en Luma plade. </li><li> Tør pladerne natten over og måle CPM ved hjælp af en gammatæller. </li></ol>le &quot;&gt; 5.. procent lyse Beregning <ol><li> Impedans assay: Tag impedans læsning, rapporteret som cellen indeks (CI), på forskellige tidspunkter, og bruge følgende formel til at bestemme procent lyse: (CI tumor kun - (CI tumor + T-celler)) / (CI tumor only) * 100. </li><li> CRA: Brug følgende formel til at bestemme procent lyse: (CPM eksperimentel - CPM spontan) / (CPM maksimum - CPM spontan) * 100. </li></ol> 6.. Repræsentative resultater T-celler alene ikke øger impedans T-celler, i almindelighed, ikke overholder de fleste faste overflader og kræver ikke tilslutning til aktivering og proliferation. Derfor blev det antaget, at T-celler ikke bør bidrage til impedans på xCelligence E-plader. For at teste dette, blev brønde fyldt med enten SKBR3 brystcancerceller eller frisk oprensede humane CD8 T-celler. Impedans blev målt i løbet af 40 timer, og et repræsentativt eksempel demonstbedømmelse væsentlige ringe effekt af T-celler er vist i figur 1A. Derimod kan det hævdes, at T-celler kan mindske baggrund impedans, omend kun lidt. Alligevel viser co-kultur, at processen med at tilføje T-celler ved 18 timer efter påbegyndelse af impedansmålinger resulterede i en impedans afbrydelse (figur 1B). Andre undersøgelser viste, at afbrydelser skyldtes delvis håndtering da formindskelsen i signalet kan reduceres ved at sikre, at temperaturen af ​​den T-celle-holdige opløsning blev den samme som i det indre af inkubatoren. Reduktioner i impedans medieret af T-celler er dosisafhængig. Anvendeligheden af ​​en impedans-baseret assay at sammenligne prøver til cytotoksisk T-celle aktivitet kræver evnen til at skelne mellem forskellige koncentrationer af antigen-specifikke T-celler. At teste, om dette er muligt, SKBR3 celler blev co-dyrket med varierende koncentrationertioner af T-celler afledt fra en HER-2/neu p369-specifik T-cellelinie. Som vist i figur 2A, reduktioner i impedans var dosisafhængig af T-celler. 2b viser at cellernes indeks på 10 timer følge en simpel anden ordens polynomium over området af T-celler. Således xCelligence station overvåger CD8 T-celle medieret død SKBR3 tumorer i realtid som en dråbe i celle indeks. Den impedans-baserede assay detekterer antigen-specifikke T-celler At afgøre, om reduktioner i impedans af SKBR3, hvilket er et HER-2/neu og HLA-A2 positiv brystkræft tumor cellelinie ved HER-2/neu p369-specifikke T-celler var antigenspecifikke, separate brønde indeholdende SKBR3 blev også inkuberet med T-celler afledt fra en influenza (FLU)-specifik T-cellelinie. Flu specifik T-celler tjente som en ikke-specifik kontrol, er HLA-A2 positiv, men ikke har nogen evne til at genkende HER-2/neu. Som vist i Figur 3, der er en betydelig forskel mellem den lytiske aktivitet af HER-2/neu p369-specifikke T-celler sammenlignet med FLU-specifikke T-celler (p &lt;0,0001). I nogle tilfælde (f.eks FLU-specifik eller anti-CD3/anti-CD28 stimulerede) T-celler ikke er specifikke for tumor påvist et lavt niveau af lytisk aktivitet (figur 3A-B). T-celler kan dræbe på en af ​​to måder, enten ikke-specifikt gennem Fas: Fas ligand interaktioner eller antigen-specifikt ved frigivelse af granzymes og perforins. For yderligere underbygge den opfattelse, at HER-2/neu-specific T-celler blev dræbt i et antigen-specifik måde, vi indarbejdet et blokerende antistof mod Fas-ligand. Som vist i figur 3B har antistoffet ikke reducere den lytiske aktivitet af HER-2/neu p369-specifikke T-celler. Antistoffet kunne hæmme interaktioner mellem Fas-og Fas-ligand, som demonstreret med T-celler, der var ikke-specifikt aktiveret med anti-CD3/CD28 perler. Disse resultater antyder, at nårtumor-specifikke T-celler testes med ikke-tumor-specifikke T-celler, kan Fas-ligand blokade være nødvendig for at reducere ikke-TCR-medierede interaktioner til et minimum. Alternativt, når der anvendes korte dyrkede T-cellelinjer, hvor kun en brøkdel af T-cellerne er specifikke for antigenet, der anvendes til ex vivo generation, kan muligheden for MHC mismatch-medieret T-celleaktivering forekomme fører til ikke-specifik lysis. I dette tilfælde kan tilsætning af antistoffer, der blokerer de irrelevante HLAs være berettiget. At afgøre, om p369-specifikke T-celler dræbte tumorceller i et HLA klasse I afhængige måde, enten anti-HLA-klasse I-antistof eller isotypekontrolantistof blev tilsat til co-kulturer. Som vist i figur 3C, lysering af p369-specifikke T-celler blev undertrykt ved inklusion af antistof viser HLA klasse I restriktion. Endelig, da udviklingen af ​​denne assay i vid udstrækning blev gjort ved hjælp SKBR3, var det vigtigt at konstatere, om andre klæbende HLA-A2 og HER-2/neu udtrykkende tumorceller kan blive dræbt af p369-specifikke T-celler. Således blev T-celler fremstillet og tilsat ved en 1:5 til HLA-A2 og HER-2/neu-expressing tumorceller, SKBR3, MCF-7, og HCC1419 celler. HLA-A2-negativ tumor cellelinie, blev BT20 anvendt som en negativ kontrol. Som vist i figur 3D, alle disse ekstra tumorceller, undtagen BT20 blev også dræbt som vurderet ved impedans. Den metode synes at være anvendelige til flere mål adhærente tumorceller. Den impedans-baserede assay er mere følsom end standard-chromfrigivelsesanalyse i påvisning cytotoksisk T-celle-aktivitet Krom (51Cr) frigivelse assay (CRA), som måler cytolytisk aktivitet har længe været den gyldne standard ved at overvåge CD8 T-celle responser. I dette assay er målceller (f.eks tumorceller) mærket med 51 Cr. I de fleste tilfælde kan raske målceller bevarer størstedelen afradiomærke løbet af assayet. CD8 T celler tilsættes til målcellerne, sædvanligvis ved varierende koncentrationer, og aflivning af målcellerne påvises ved frigivelse af 51Cr til mediet. Bortset fra det faktum, at det bruger farlig stråling, to store problemer med CRA er en mangel på følsomhed og at assayet kræver typisk store mængder CD8 T-celler, hvilket begrænser dens anvendelighed. At afgøre, om impedans-baserede assay var mere følsom end CRA, HER-2/neu p369-specifikke T-celler blev genereret in vitro og anvendt i varierende mængder, at e-plader indeholdende umærkede tumorceller eller standard polypropylen plader, der indeholder 51Cr-mærkede målceller. Målinger, enten impedans eller gratis chrom, blev målt ved 5 timer efter T-celle tilføjelse. Figur 4 et repræsentativt eksempel viser impedans analysen udkonkurrerer chrom udgivelse. Den intra-assay variationaf impedans-baserede assay er typisk under 20%. Intra-assay variation blev undersøgt, da udbredt anvendelse af denne analyse vil i vid udstrækning blive bestemt af dens reproducerbar og variation (figur 5). To p369-specifikke T-cellelinjer blev frembragt uafhængigt 30 dage fra hinanden og tilsættes in triplo over et område af tumor celle til T-celle-forhold. Det indsatte graf i figur 5 viser, at linjerne var stort set tilsvarende i form af lysering SKBR3 celler. Den% variationskoefficient blev beregnet ved hver celle ratio og plottet. Som vist i figur 5 1:40 til 01:05 nøgletal for% variationskoefficienter (CV), var under 15%. På 1:2,5 og 1:1,25, dog CV&#39;er var høj eller uforudsigelige. På grund af omfattende biologiske variation, er det ikke muligt at måle inter-assay variation med primære T-cellelinier. <img src="/files/ftp_upload/3683/3683fig1.jpg" alt="Figur 1"/> Figur 1. Impedans skal normaliseres efter tilsætning af T-cellerne. Panel A: viser, at tumorceller (rød linje) og ikke T-celler (blå linie) er ansvarlige for impedans. Vist er impedans optagelserne over 40 timer for enten tumor-eller T-celler alene. Lignende resultater blev opnået fra et andet eksperiment. Bemærk, at signalet forstyrrelse på cirka 20 timer repræsenterer punktet for tilsætning af T-celler til brøndene ikke indeholder tumorceller Panel B:. Viser, at impedansmålinger forbigående er afbrudt med tilsætning af T-celler til tumorceller. Dette kræver normalisering på et tidspunkt efter tilsætning af T-celler (se punkt normalisering markeret i grafen). Traces er sammensat fra dublerede datapunkter. Sporet for tumorceller alene er vist i rødt. De andre spor repræsenterer tumorceller co-dyrket med HER-2/neu p369-specifikke T-celler (blå: forholdet 1,25 T-celler / tumorcelle, Green:forholdet 40 T-celler / tumor celle). Hvert spor er beregnet ud fra dobbeltbestemmelser datapunkter indsamlet hver 5 minutter gennem varigheden af ​​kulturen. Resultaterne er repræsentative for 3 separate eksperimenter. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3683/3683fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se større figur</a> . <img src="/files/ftp_upload/3683/3683fig2.jpg" alt="Figur 2"/> Figur 2. Reduktion i impedans medieret af T-celler er dosisafhængig. Panel A: Vist er impedans spor af SKBR3 tumorceller inkuberet alene eller med varierende koncentrationer af tumor-specifikke T-celler. Hvert spor er beregnet ud fra tredobbelte datapunkter indsamlet hver 5 minutter gennem varigheden af ​​kulturen. Resultaterne er repræsentative for 3 separate eksperimenter Panel B:. Vist er den celle indeks ved 10 timer på tværs alle T-celle / tumor cellekoncentrationer. Den stiplede linie repræsenterer cellen indekset for tumorceller alén. Hvert symbol er middelværdien (± SEM) af tredobbelte bestemmelser. Resultaterne er repræsentative for 3 separate eksperimenter. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3683/3683fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se større figur</a> . <img src="/files/ftp_upload/3683/3683fig3.jpg" alt="Figur 3"/> Figur 3. Impedans baseret analyse påviser antigen-specifikke cytotoksiske T-celle-responser. Panel A viser niveauet af lyse af SKBR3 celler ved HER-2/neu p369-specifikke T-celler (rød) eller influenza-specifikke T-celler (blå) ved 5, 10 og 15 timer efter co-dyrkning. Hvert datapunkt er middelværdien (± SEM) af tredobbelte målinger. Resultaterne er repræsentative for 3 separate forsøg. Panel B viser lysis af SKBR3 af p369-specifikke T-celler eller ikke-specifikt aktiverede T-celler, hvilket viser, at antigen-specifik lysis skyldes ikke Fas-Fas ligand-interaktioner. Sorte bjælker repræsenterer co-kulturer,indeholdt en Fas-ligand antistof. Hver søjle er middelværdien (± SEM) lysering i tredobbeltbestemmelse ved 5 timer efter tilsætningen af ​​T-celler. Resultaterne er repræsentative for 3 separate forsøg. Panel C viser lysis 10 timer efter T-celle tilsætning af SKBR3 af p369-specifikke T-celler er HLA-klasse I afhængige. Enten HLA-klasse I blokering eller isotypekontrol blev tilføjet i løbet af co-kultur. Hver søjle er middelværdien (± SEM) lysering i tre eksemplarer. Dette eksperiment blev gentaget to gange med lignende resultater. Panel D viser% lysis 10 timer efter T-celle tilsætning af flere HLA-A2 +, HER-2/neu-expressing tumorcellelinier ved p369-specifikke T-celler. BT20, blev en HLA-A2-negativ brystkræft cellelinie anvendt som en negativ kontrol. Hver plet repræsenterer et enestående eksperiment beregnet ud fra tredobbelte bestemmelser. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3683/3683fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se større figur</a> . <img src = &quot;/ files/ftp_upload/3683/3683fig4.jpg&quot; alt = &quot;Figur 4&quot; /&gt; Figur 4.. Impedans baseret assay er mere følsom end chromfrigivelsesanalyse til påvisning af tumor antigen-specifikke T-celler. Vist er% lysis af SKBR3 som reaktion på forskellige koncentrationer af p369-specifikke T-celler som målt ved 5 timer efter tumor og T-celle blanding ved hjælp af både impedans-baserede assay og chromfrigivelsesanalyse. Hvert symbol er middelværdien (± SEM) af tre gentagelser. Resultaterne er repræsentative for 3 separate forsøg. <img src="/files/ftp_upload/3683/3683fig5.jpg" alt="Figur 5"/> Figur 5. % Intra-assay variationskoefficienter af impedans-baserede T-celle cytotoksicitet assay. Vist er middelværdier (± SD)% intra-assay variationskoefficienter i lysis af SKBR3 over en række koncentrationer af antigen-specifikke T-celler. Hvert symbol er middelværdien af ​​tre gentagelser. Numre, der vises i grafen er than mener% CV. Indsat panel viser den middel (± SEM, n = 3)% lysis af SKBR3 ved varierende koncentrationer af p369-377-specifikke T-celler. To uafhængigt genereret p369-specifikke T-cellelinier med T-celler fra to separate donorer er vist.

<ol>
	<li>Zhang, N., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8(+)+T+cells:+foot+soldiers+of+the+immune+system.">CD8(+) T cells: foot soldiers of the immune system.</a> Immunity. 35, 161-168 (2011).</li><li>Garboczi, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+complex+between+human+T-cell+receptor,+viral+peptide+and+HLA-A2.">Structure of the complex between human T-cell receptor, viral peptide and HLA-A2.</a> Nature. 384, 134-141 (1996).</li><li>Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+analysis+of+T-cell+immunity.">Laboratory analysis of T-cell immunity.</a> Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).</li><li>Andersen, M. H., Schrama, D., Thor Straten, P., Becker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cytotoxic T cells. J. Invest. Dermatol. 126, 32-41 (2006).</li><li>Weren, A., Bonnekoh, B., Schraven, B., Gollnick, H., Ambach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+flow+cytometric+assay+focusing+on+perforin+release+mechanisms+of+cytotoxic+T+lymphocytes.">A novel flow cytometric assay focusing on perforin release mechanisms of cytotoxic T lymphocytes.</a> J. Immunol. Methods. 289, 17-26 (2004).</li><li>Aktas, E., Kucuksezer, U. C., Bilgic, S., Erten, G., Deniz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+CD107a+expression+and+cytotoxic+activity.">Relationship between CD107a expression and cytotoxic activity.</a> Cell Immunol. 254, 149-154 (2009).</li><li>Knutson, K. L., Schiffman, K., Disis, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+a+HER-2/neu+helper+peptide+vaccine+generates+HER-+2/neu+CD8+T-cell+immunity+in+cancer+patients.">Immunization with a HER-2/neu helper peptide vaccine generates HER- 2/neu CD8 T-cell immunity in cancer patients.</a> J. Clin. Invest. 107, 477-484 (2001).</li><li>Asiedu, M. K., Ingle, J. N., Behrens, M. D., Radisky, D. C., Knutson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta/TNF(alpha)-mediated+epithelial-mesenchymal+transition+generates+breast+cancer+stem+cells+with+a+claudin-low+phenotype.">TGFbeta/TNF(alpha)-mediated epithelial-mesenchymal transition generates breast cancer stem cells with a claudin-low phenotype.</a> Cancer Res. 71, 4707-4719 (2011).</li><li>Strijbosch, L. W., Buurman, W. A., Does, R. J., Zinken, P. H., Groenewegen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limiting+dilution+assays.+Experimental+design+and+statistical+analysis.">Limiting dilution assays. Experimental design and statistical analysis.</a> J. Immunol. Methods. 97, 133-140 (1987).</li><li>Gallimore, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+exhaustion+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+visualized+using+soluble+tetrameric+major+histocompatibility+complex+class+I-peptide+complexes.">Induction and exhaustion of lymphocytic choriomeningitis virus-specific cytotoxic T lymphocytes visualized using soluble tetrameric major histocompatibility complex class I-peptide complexes.</a> J. Exp. Med. 187, 1383-1393 (1998).</li></ol>

Produktion og fri adgang til denne video-artikel er sponsoreret af Roche Diagnostics.

CD8 T-celler er vigtige for den adaptive immunrespons, være i stand til direkte dræbe inficerede eller maligne celler 4.. Selvom der er flere måder at måle antallet af antigen-specifikke CD8 T-celler (f.eks ELIspot, tetramer, flowcytometri), ofte er det nyttigt at vide, om disse celler er funktionelt cytotoksiske 3.. Den mest genkendelige assay til at vurdere cytotoksisk funktion er CRA, hvilket betragtes som den gyldne standard assay 4.. Store begrænsninger af CRA er (1) kravet om radioaktivitet, (2) manglende følsomhed, (3) manglende mekanistisk information, (4) for store mængder af celler, og (5) omstændelig sæt op. Således i det seneste årti har der været interesse i at vedtage nye strategier for at minimere disse begrænsninger. Nyere tilgange omfatter dem, der måler caspase release 4, BLT esterase aktivitet5 og overflade udtryk for CD107 6.. Den foreliggende manuskript antyder, atimpedans-baserede assay udføres på Roche xCelligence system, kan også være nyttige som et alternativ til CRA. Evnen til at tilpasse impedans tilgang hviler på den iagttagelse, at T-celler, som ikke er fastbrændt tæt til overflader, ikke synes at have meget indflydelse på impedans og dermed mindske nogen bekymring for direkte indblanding af de T-celler med målingen. Det arbejde, som kræves for brug af impedans assaysystem forventes at være betydeligt mindre primært på grund af fjernelsen af ​​de regulatoriske bekymringer for anvendelsen af ​​radioaktivitet. Den eneste bemærkelsesværdige ulempe impedans-baserede system er, at en udlæg på $ 50.000 til $ 60,000 er nødvendig for køb af xCelligence enheden. Imidlertid xCelligence enhed eliminerer behovet for en stråling tæller og er langt mere alsidig, er anvendelige til at vurdere cellulær reaktion på narkotika og migration i tillæg til T-celle cytotoksicitet 8.. Observationerne, derformindskelsen i tumorcelle impedans er dosisafhængig, som afbildet i figur 2, med en rimelig stejl skråning efter en simpel sekundær kvadratisk funktion tyder på, at assayet kan anvendes i begrænset fortynding assays (LDAs) at estimere frekvensen af cytotoksiske celler 9 . En fordel med den impedans tilgang er, at antallet af T-celler, der kræves og tumorceller er mindre end CRA, hvilket gør LDA potentielt mere gennemførlig. For eksempel, i CRA på en 01:40-forhold, er 1 x 10 5 tumorceller per brønd belagt som kræver 4 x 10 6 totale T-celler pr. Men i impedans-baserede assay kun 1,5 x 10 4 tumorceller per brønd nødvendig, hvilket forbruger kun 6 x 10 5 totale T-celler pr. Således impedans-baserede assay bruger 85% mindre T-celler og tumorceller. Denne reduktion antyder, at impedans-baserede system kunne tilpasses til immunologisk overvågning i humane kliniske undersøgelser, hvor than blodvolumen trækker kan begrænses. Også, mens CRA er begrænset til et enkelt tidspunkt, impedans-baserede assay indsamler løbende data i realtid, så brugeren kan sammenligne flere lysistid point på samme eksperiment med minimal ekstra arbejdskraft og celler. Frekvens beregninger potentielt kunne kombineres med andre strategier, der ikke måler funktion såsom tetramere analyser at fastslå forholdet mellem funktionelle cytotoksiske T-celler til den samlede antigenspecifikke CD8 T-celler 10. En af de mest tiltalende træk ved den impedans tilgang er, at i modsætning til de fleste andre assays, kan cytotoksicitet blive overvåget i realtid, der potentielt gør det lettere at studere cellulære interaktioner med anvendelse af inhibitorer eller antistoffer. En anden er, at metoden kan være egnet til tumorceller, der modstår mærkning. Endelig, eftersom de ikke-dræbte tumorceller ikke er mærket og forbliver sterile, yderligere høst og undersøgelse af T-celle-resistente celler er possible. Sammenfattende, mens begge systemer giver tumordrab data som reaktion på specifikke T-celler impedans-baserede assay er mere følsom end CRA og giver en mere fleksibel platform.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ficoll-Paque Plus </td>
 <td>GE Healthcare </td>
 <td>17-1440-03 </td>
 <td>Used to isolate PBMCs from blood </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI 1640 </td>
 <td>Cellgro </td>
 <td>10-040-CV </td>
 <td>Cell culture media </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FBS </td>
 <td>Denville Scientific </td>
 <td>FB5001-H </td>
 <td>Cell culture media </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human IL-2 </td>
 <td>eBioscience </td>
 <td>14-8029-81 </td>
 <td>For stimulating growth of T cells </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human Interferon gamma </td>
 <td>Cell Sciences </td>
 <td>CR2026 </td>
 <td>For stimulating MHC expression in tumor cells </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HER-2/neu p369-377 peptide </td>
 <td>Mayo Clinic peptide synthesis core </td>
 <td>amino acid sequence KIFGSLAFL </td>
 <td>Binds to HLA-A2 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Influenza p58-66 peptide </td>
 <td>Mayo Clinic peptide synthesis core </td>
 <td>amino acid sequence GILGFVFTL </td>
 <td>Binds to HLA-A2 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human CD3/CD28 Dynabeads </td>
 <td>Invitrogen </td>
 <td>111-61D </td>
 <td>For non-specific T cell activation and expansion </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chromium-51 </td>
 <td>MP Biomedicals </td>
 <td>62015 </td>
 <td>CRA labeling reagent </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E-plate </td>
 <td>Roche Applied Science </td>
 <td>05469830001 </td>
 <td>For xCelligence impedance unit </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Luma plate 96 </td>
 <td>Perkin Elmer </td>
 <td>6005630 </td>
 <td>For measuring radioactivity in the Top Count NXT. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>xCelligence RTCA DP Station </td>
 <td>Roche Applied Science </td>
 <td>RTCA DP </td>
 <td>Impedance unit </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Top Count NXT </td>
 <td>Perkin Elmer </td>
 <td>C990601 </td>
 <td>Scintillation &amp; Luminescence Counter </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fas Ligand antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>556372</td>
 <td>For blocking Fas-Fas ligand interactions</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HLA-A2 BB7.2 antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>551230</td>
 <td>For blocking HLA class I</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mouse IgG2b, &kappa;</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555740</td>
 <td>Isotype control for HLA class I</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SKBR3 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-30</td>
 <td>Adenocarcinoma</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MCF7 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-22</td>
 <td>Adenocarcinoma</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HCC1419 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>CRL-2326</td>
 <td>Primary ductal carcinoma</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BT20 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-19</td>
 <td>Carcinoma</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

determining optimal cytotoxic activity of human her2neu specific cd8 t cells by comparing the cr51 release assay to the xcelligence system

Cytotoksiske CD8 T-celler udgør en undergruppe af T-celler, der er i stand til at inducere død af inficerede eller maligne værtsceller 1.. Disse celler udtrykker en specialiseret receptor, kaldet T-cellereceptoren (TCR), som kan genkende et specifikt antigent peptid bundet til HLA klasse I-molekyler 2.. Engagement af inficerede celler eller tumorceller gennem deres HLA klasse I-molekyle resulterer i produktion af lytiske molekyler såsom granzymes og perforin resulterer i mål celledød. Selv om det er nyttigt at bestemme frekvenserne af antigen-specifikke CD8 T-celler ved hjælp af assays, såsom ELISPOT eller flowcytometri, er det også nyttigt at fastslå styrken af CD8 T-celle responser hjælp cytotoksicitetsassays 3.. Den mest genkendelige assay til at vurdere cytotoksisk funktion er chromfrigivelsesanalyse (CRA), der betragtes som en standard assay 4.. CRA har flere begrænsninger, herunder udsættelse af celler for gammastråling, lack af reproducerbarhed, og et krav om et stort antal celler. Gennem det seneste årti har der været interesse i at vedtage nye strategier for at overvinde disse begrænsninger. Nyere tilgange omfatter dem, der måler caspase release 4, BLT esteraseaktivitet 5 og overflade udtryk for CD107 6.. Impedans-baserede assay, ved hjælp af Roche xCelligence systemet blev undersøgt i nærværende papir til sit potentiale som et alternativ til CRA. Impedans eller modstand mod en elektrisk strøm opstår, når adhærente tumorceller binde til elektrodeplader. Tumorceller løsrive efter aflivning og elektriske impedans reduceres som kan måles ved xCelligence system. Evnen til at tilpasse impedans tilgang til vurdering cellemedieret drab hviler på den iagttagelse, at T-celler ikke overholder tæt til de fleste overflader og synes ikke at have meget indflydelse på impedans og dermed mindske nogen bekymring for direkte indblanding af de T-celler medmålingen. Resultater viser, at den impedans-baserede assay kan detektere ændringer i niveauerne af antigen-specifikke cytotoksiske CD8 T-celler med øget følsomhed i forhold til standarden CRA. Baseret på disse resultater, kan impedans tilgange være gode alternativer til kreditvurderingsbureauer eller andre tilgange har til formål at måle cytotoksiske CD8 T-celle funktionalitet.

Watch this Scientific Journal Video about Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System at JoVE.com

Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System

Den chromfrigivelsesanalyse, en fælles assay til påvisning cytotoksisk T-celle-aktivitet, har adskillige begrænsninger. Brug antigenspecifikke CD8 T-celler og human brystcancer tumor linje, SKBR3, i nærværende artikel, var en impedans tilgang undersøgt for evnen til at detektere celledrab.

Bestemmelse Optimal cytotoksisk aktivitet for Human Her2neu Specifikke CD8 T-celler ved at sammenligne de Cr51 Udgivelse Assay til xCELLigence System

Cytotoxic CD8 T cells constitute a subgroup of T  cells that are capable of inducing the death of infected or malignant host  cells1. These cells express ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

In vitro assay at evaluere virkningen af immunoregulerende Pathways på HIV-specifikke CD4 T-celle effektorfunktion

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cell-baserede Flowcytometri Assay til måling cytotoksisk aktivitet

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Vurdering af Innate Sensing af HIV-1 inficerede CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-celler ved plasmacytoide dendritiske celler ved hjælp af en<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-dyrkningssystem.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

Generation af human alloantigen-specifikke T-celler fra perifert blod

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

Automatiseret Cell Berigelse af cytomegalovirus-specifikke T-celler til kliniske applikationer ved hjælp af Cytokin-capture system

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Udvikling af Stem Cell-afledte antigen-specifikke regulatoriske T celler mod Autoimmunitet

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Analyse af Simian Immunodeficiency Virus-specifikke CD8<sup&gt; +</sup&gt; T-celler i makakaber efter Peptid-MHC-I tetramerfarvning

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-tetramer farvning og kvantitativ analyse til at bestemme placering, overflod og fænotype af Antigen-specifikke CD8 T celler i væv

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Højeffektiv generation af antigen-specifikke primære mus cytotoksiske T-celler til funktionel testning i en autoimmun diabetes model

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...