Name: determining optimal cytotoxic activity of human her2neu specific cd8 t cells by comparing the cr51 release assay to the xcelligence system
Uploaded: 2012-08-08T12:00:00
Duration: 11 min 31 s
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Ce travail a été soutenu par des subventions à Keith L. Knutson de la Susan G. Komen pour la Fondation Cure et les NIH / NCI 9R01 CA152045 et CA116201-P50.

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Production et le libre accès de cette vidéo-article est sponsorisé par Roche Diagnostics.

Lymphocytes T CD8 sont importants pour la réponse immunitaire adaptative, être capable de tuer directement les cellules infectées ou malignes 4. Bien qu&#39;il existe plusieurs façons de mesurer le nombre de cellules T CD8 spécifiques de l&#39;antigène (par exemple ELIspot, tétramère, cytométrie en flux), il est souvent utile de savoir si ces cellules sont fonctionnellement cytotoxique 3. Le test le plus reconnaissable pour évaluer la fonction cytotoxique est l&#39;ARC, qui est considéré comme le 4 test étalon-or. Principales limites de l&#39;ARC sont (1) l&#39;exigence de la radioactivité, (2) le manque de sensibilité, (3) le manque d&#39;information sur le mécanisme, (4) l&#39;obligation pour les grandes quantités de cellules, et (5) ensemble laborieuse. Ainsi, au cours de la dernière décennie, il ya eu intérêt à adopter de nouvelles stratégies pour réduire ces limitations. Les approches plus récentes sont celles qui mesure la caspase version 4, BLT estérase activité5, et l&#39;expression de surface de CD107 6. Le présent manuscrit suggère quele dosage à base d&#39;impédance, effectué sur le système xCELLigence Roche, peut également être utile en tant qu&#39;alternative à l&#39;ARC. La capacité d&#39;adapter l&#39;approche à base d&#39;impédance repose sur l&#39;observation que les cellules T, qui n&#39;adhèrent pas bien aux surfaces, ne semblent pas avoir beaucoup d&#39;impact sur l&#39;impédance diminuant ainsi toute préoccupation d&#39;intervention directe des cellules T avec la mesure. Le travail requis pour l&#39;utilisation du système d&#39;analyse d&#39;impédance devrait être nettement moins principalement due à l&#39;élimination des préoccupations d&#39;ordre réglementaire pour l&#39;utilisation de la radioactivité. Le seul inconvénient notable du système à base d&#39;impédance, c&#39;est une dépense de 50.000 $ à 60.000 $ est exigé pour l&#39;achat de l&#39;unité de xCELLigence. Cependant, l&#39;unité de xCELLigence élimine le besoin d&#39;un compteur de radiation et est beaucoup plus polyvalent, être utile pour évaluer la réponse cellulaire aux médicaments et à la migration, en plus de la cytotoxicité des cellules T 8. Les observations quela diminution de l&#39;impédance de la cellule tumorale est dose-dépendante, comme le montre la figure 2, avec une pente assez raide après une fonction quadratique secondaire simple, suggère que le test pourrait être utilisé dans la limitation des essais de dilution (ADL) pour estimer la fréquence des cellules cytotoxiques 9 . Un avantage de l&#39;approche à base d&#39;impédance est que le nombre de cellules T et les cellules tumorales requise est inférieure à l&#39;ARC, faisant LDA potentiellement plus réalisable. Par exemple, à l&#39;ARC, à un rapport de 1:40 1 x 10 5 cellules tumorales par puits sont plaquées qui nécessite 4 x 10 6 cellules totales T par puits. Toutefois, dans le dosage à base d&#39;impédance, à seulement 1,5 x 10 4 cellules tumorales par puits sont nécessaires, qui ne consomme que 6 x 10 5 cellules T totale par puits. Ainsi, le dosage à base d&#39;impédance utilise des cellules T 85% de moins et les cellules tumorales. Cette diminution suggère que le système à base d&#39;impédance pourrait être adapté à la surveillance immunologique dans les essais cliniques chez l&#39;homme où til volumes de prélèvements sanguins peut être limitée. Par ailleurs, si l&#39;ARC est limitée à un seul moment, le dosage à base d&#39;impédance recueille des données en continu en temps réel, ce qui permet à l&#39;utilisateur de comparer plusieurs points dans le temps de lyse sur la même expérience avec un minimum de travail et les cellules supplémentaires. calculs de fréquence pourraient être combinées avec d&#39;autres stratégies qui ne mesurent pas la fonction telles que les analyses tétramère d&#39;établir le rapport des cellules T cytotoxiques fonctionnels au nombre total de lymphocytes T CD8 spécifiques de l&#39;antigène 10. Une des caractéristiques les plus intéressantes de l&#39;approche à base d&#39;impédance, c&#39;est que, contrairement à la plupart des autres tests, la cytotoxicité peut être suivie en temps réel, rendant potentiellement plus faciles à étudier les interactions cellulaires avec l&#39;utilisation d&#39;inhibiteurs ou d&#39;anticorps. Une autre est que le procédé peut être adapté pour les cellules tumorales qui résistent à l&#39;étiquetage. Enfin, puisque les cellules tumorales non-tués ne sont pas étiquetés et restent stériles, plus la récolte et l&#39;étude des cellules cellules résistantes T est possible. En résumé, alors que les deux systèmes fournissent des données tuant tumorales en réponse à cellules T spécifiques, le dosage à base d&#39;impédance est plus sensible que l&#39;ARC et fournit une plate-forme plus flexible.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ficoll-Paque Plus </td>
 <td>GE Healthcare </td>
 <td>17-1440-03 </td>
 <td>Used to isolate PBMCs from blood </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI 1640 </td>
 <td>Cellgro </td>
 <td>10-040-CV </td>
 <td>Cell culture media </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FBS </td>
 <td>Denville Scientific </td>
 <td>FB5001-H </td>
 <td>Cell culture media </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human IL-2 </td>
 <td>eBioscience </td>
 <td>14-8029-81 </td>
 <td>For stimulating growth of T cells </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human Interferon gamma </td>
 <td>Cell Sciences </td>
 <td>CR2026 </td>
 <td>For stimulating MHC expression in tumor cells </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HER-2/neu p369-377 peptide </td>
 <td>Mayo Clinic peptide synthesis core </td>
 <td>amino acid sequence KIFGSLAFL </td>
 <td>Binds to HLA-A2 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Influenza p58-66 peptide </td>
 <td>Mayo Clinic peptide synthesis core </td>
 <td>amino acid sequence GILGFVFTL </td>
 <td>Binds to HLA-A2 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human CD3/CD28 Dynabeads </td>
 <td>Invitrogen </td>
 <td>111-61D </td>
 <td>For non-specific T cell activation and expansion </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chromium-51 </td>
 <td>MP Biomedicals </td>
 <td>62015 </td>
 <td>CRA labeling reagent </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E-plate </td>
 <td>Roche Applied Science </td>
 <td>05469830001 </td>
 <td>For xCelligence impedance unit </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Luma plate 96 </td>
 <td>Perkin Elmer </td>
 <td>6005630 </td>
 <td>For measuring radioactivity in the Top Count NXT. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>xCelligence RTCA DP Station </td>
 <td>Roche Applied Science </td>
 <td>RTCA DP </td>
 <td>Impedance unit </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Top Count NXT </td>
 <td>Perkin Elmer </td>
 <td>C990601 </td>
 <td>Scintillation &amp; Luminescence Counter </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fas Ligand antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>556372</td>
 <td>For blocking Fas-Fas ligand interactions</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HLA-A2 BB7.2 antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>551230</td>
 <td>For blocking HLA class I</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mouse IgG2b, &kappa;</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555740</td>
 <td>Isotype control for HLA class I</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SKBR3 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-30</td>
 <td>Adenocarcinoma</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MCF7 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-22</td>
 <td>Adenocarcinoma</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HCC1419 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>CRL-2326</td>
 <td>Primary ductal carcinoma</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BT20 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-19</td>
 <td>Carcinoma</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

determining optimal cytotoxic activity of human her2neu specific cd8 t cells by comparing the cr51 release assay to the xcelligence system

Lymphocytes T CD8 cytotoxiques constituent un sous-groupe de cellules T qui sont capables d&#39;induire la mort des cellules hôtes infectées ou malignes 1. Ces cellules expriment un récepteur spécialisé, appelé le récepteur des cellules T (TCR), qui peut reconnaître un peptide antigénique spécifique lié à HLA de classe I molécules de 2. Engagement des cellules infectées ou des cellules tumorales par leur classe I résultats de molécules HLA dans la production de molécules lytiques comme granzymes et perforine entraînant la mort de la cellule cible. Bien qu&#39;il soit utile pour déterminer les fréquences de cellules spécifiques de l&#39;antigène T CD8 en utilisant des analyses telles que la ELIspot ou la cytométrie de flux, il est également utile pour évaluer la solidité de réponses CD8 des lymphocytes T à l&#39;aide de tests de cytotoxicité 3. Le test le plus reconnaissable pour évaluer la fonction cytotoxique est le test de libération du chrome (ARC), qui est considéré comme un 4 de dosage standard. L&#39;ARC présente plusieurs limites, notamment l&#39;exposition des cellules aux radiations gamma, lack de reproductibilité et une exigence pour un grand nombre de cellules. Au cours de la dernière décennie, il ya eu intérêt à adopter de nouvelles stratégies pour surmonter ces limitations. Les approches plus récentes sont celles qui mesure la caspase version 4, l&#39;activité estérase BLT 5 et l&#39;expression de surface de CD107 6. Le dosage à base d&#39;impédance, en utilisant le système de xCELLigence Roche, a été examiné dans le présent document pour son potentiel en tant qu&#39;alternative à l&#39;ARC. Impédance ou en opposition à un courant électrique se produit lorsque les cellules tumorales adhérentes se lient aux plaques d&#39;électrodes. Les cellules tumorales se détachent après meurtre et l&#39;impédance électrique est réduite, ce qui peut être mesuré par le système de xCELLigence. La capacité d&#39;adapter l&#39;approche à base d&#39;impédance pour évaluer mort à médiation cellulaire repose sur l&#39;observation que les cellules T n&#39;adhèrent pas bien à la plupart des surfaces et ne semblent pas avoir beaucoup d&#39;impact sur l&#39;impédance diminuant ainsi toute préoccupation d&#39;ingérence directe des cellules T avecla mesure. Les résultats montrent que le test à base d&#39;impédance peut détecter des changements dans les niveaux de lymphocytes T CD8 cytotoxiques spécifiques de l&#39;antigène avec une sensibilité accrue par rapport à la norme ARC. Sur la base de ces résultats, les approches à base d&#39;impédance peuvent être de bonnes alternatives aux agences de notation ou d&#39;autres approches qui visent à mesurer la fonctionnalité des cellules cytotoxiques CD8 T.

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Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System

Le test de libération du chrome, un dosage commun pour détecter l&#39;activité des cellules T cytotoxiques, présente plusieurs limitations. En utilisant des cellules T CD8 spécifiques de l&#39;antigène et la ligne de tumeur du cancer du sein humain, SKBR3, dans le présent article, une approche à base d&#39;impédance a été examiné pour la capacité de détecter la destruction des cellules.

Détermination de l&#39;activité cytotoxique CD8 spécifiques optimale des cellules T humaines Her2neu en comparant les Cr51 Essai de libération dans le système de xCELLigence

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