Name: determining optimal cytotoxic activity of human her2neu specific cd8 t cells by comparing the cr51 release assay to the xcelligence system
Uploaded: 2012-08-08T12:00:00
Duration: 11 min 31 s
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Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse zu Keith L. Knutson von der Susan G. Komen for the Cure Foundation und NIH / NCI 9R01 CA152045 und P50-CA116201 unterstützt.

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CD8-T-Zellen sind wichtig für die adaptive Immunantwort, die Möglichkeit, direkt zu töten infizierte oder maligne Zellen 4. Zwar gibt es mehrere Möglichkeiten, um die Zahl von Antigen-spezifischen CD8-T-Zellen (zB ELIspot, Tetramer, Durchflusszytometrie) messen sind, ist es oft hilfreich zu wissen, ob diese Zellen funktionell zytotoxischen 3 sind. Die bekanntesten Assay zur Beurteilung zytotoxische Funktion ist die CRA, die als Goldstandard Assay 4. Wesentliche Einschränkungen der CRA sind (1) das Erfordernis der Radioaktivität, (2) mangelnde Sensibilität, (3) Mangel an mechanistische Informationen, (4) Voraussetzung für große Mengen von Zellen, und (5) aufwändige Einrichtung. So im letzten Jahrzehnt hat es Interesse an der Einführung neuer Strategien, um diese Einschränkungen zu minimieren. Neuere Ansätze sind diejenigen, die Maßnahme Caspase Release 4, BLT Esterase activity5 und Oberflächenexpression von CD107 6. Die vorliegende Manuskript darauf hin, dassdie Impedanz-basierten Assays, auf der Roche XCELLIGENCE System durchgeführt wird, kann auch nützlich sein, als Alternative zu der CRA. Die Fähigkeit, die Impedanz-basierte Ansatz anzupassen beruht auf der Beobachtung, dass T-Zellen, die nicht beachtet dicht an Oberflächen, scheinen nicht viel Einfluss auf die Impedanz wodurch sich jede Sorge der direkten Beeinflussung der T-Zellen bei der Messung haben. Die Arbeit für die Verwendung der Impedanz-Assay-System benötigt wird erwartet, dass deutlich weniger erster Linie auf den Wegfall der regulatorischen betrifft die Verwendung von Radioaktivität. Die einzige nennenswerte Nachteil der Impedanz-basiertes System ist, dass ein Aufwand von $ 50.000 bis $ 60.000 für den Kauf des XCELLIGENCE Einheit erforderlich ist. Jedoch eliminiert die XCELLIGENCE Einheit die Notwendigkeit einer Strahlung Zähler und ist vielseitiger, nützlich ist für die Beurteilung der zellulären Antwort auf Drogen und Migration zusätzlich zu T-Zell-Zytotoxizität 8. Die Beobachtungen, dassdie Verminderung in Tumorzellen Impedanz ist dosisabhängig schlägt, wie in 2 dargestellt ist, mit einer relativ steilen Steigung nach einem einfachen sekundären quadratischen Funktion, dass der Test in limitierender Verdünnung Assays (LDA), um die Frequenz von zytotoxischen Zellen 9 Abschätzen verwendet werden . Ein Vorteil, der mit der Impedanz-Ansatz ist, dass die Zahl der T-Zellen und Tumorzellen erforderlich kleiner als der CRA ist, so dass LDA potentiell durchführbar. Zum Beispiel in der CRA bei einer 1.40 Verhältnis, 1 x 10 5 Tumorzellen pro Vertiefung ausplattiert, welche benötigt 4 x 10 6 insgesamt T-Zellen pro Vertiefung. In der Impedanz-basierten Test werden nur 1,5 x 10 4 Zellen pro Vertiefung Tumor benötigt, die verbraucht nur 6 x 10 5 Gesamt-T-Zellen pro well. Somit verwendet die Impedanz-Assay 85% weniger T-Zellen und Tumorzellen. Diese Reduktion legt nahe, dass die Impedanz-basiertes System zur immunologischen Überwachung könnte in klinischen Studien am Menschen angepasst werden, wobei ter Mengen von Blutabnahmen kann begrenzt werden. Auch wenn das CRA zu einem einzigen Zeitpunkt begrenzt wird, sammelt sich die Impedanz-Assay kontinuierliche Echtzeit-Daten, so dass der Benutzer mehrere Lyse Zeitpunkten auf demselben Experiment mit minimaler zusätzlicher Arbeits-und Zellen zu vergleichen. Frequenzberechnungen möglicherweise mit anderen Strategien, die nicht messen Funktion wie Tetramer-Analysen, um das Verhältnis von funktionellen zytotoxische T-Zellen zur gesamten Antigen-spezifischen CD8-T-Zellen 10 herzustellen kombiniert werden. Eines der attraktiven Merkmale des Impedanz-Ansatzes besteht darin, dass, im Gegensatz zu den meisten anderen Assays Zytotoxizität in Echtzeit überwacht werden, möglicherweise macht es einfacher, zelluläre Interaktionen mit der Verwendung von Inhibitoren oder Antikörpern zu studieren. Ein weiterer Grund ist, dass das Verfahren geeignet sein können Tumorzellen, die Kennzeichnung zu widerstehen. Schließlich, da die nicht abgetöteten Tumorzellen nicht beschriftet und steril bleiben weiter Ernte und Untersuchung der T-Zell-resistente Zellen possible. Zusammenfassend, wenn beide Systeme Tumorabtötung Daten in Reaktion auf spezifische T-Zellen zu schaffen, ist die Impedanz-Assay empfindlicher als der CRA und bietet eine flexible Plattform.

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 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ficoll-Paque Plus </td>
 <td>GE Healthcare </td>
 <td>17-1440-03 </td>
 <td>Used to isolate PBMCs from blood </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI 1640 </td>
 <td>Cellgro </td>
 <td>10-040-CV </td>
 <td>Cell culture media </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FBS </td>
 <td>Denville Scientific </td>
 <td>FB5001-H </td>
 <td>Cell culture media </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human IL-2 </td>
 <td>eBioscience </td>
 <td>14-8029-81 </td>
 <td>For stimulating growth of T cells </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human Interferon gamma </td>
 <td>Cell Sciences </td>
 <td>CR2026 </td>
 <td>For stimulating MHC expression in tumor cells </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HER-2/neu p369-377 peptide </td>
 <td>Mayo Clinic peptide synthesis core </td>
 <td>amino acid sequence KIFGSLAFL </td>
 <td>Binds to HLA-A2 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Influenza p58-66 peptide </td>
 <td>Mayo Clinic peptide synthesis core </td>
 <td>amino acid sequence GILGFVFTL </td>
 <td>Binds to HLA-A2 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human CD3/CD28 Dynabeads </td>
 <td>Invitrogen </td>
 <td>111-61D </td>
 <td>For non-specific T cell activation and expansion </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chromium-51 </td>
 <td>MP Biomedicals </td>
 <td>62015 </td>
 <td>CRA labeling reagent </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E-plate </td>
 <td>Roche Applied Science </td>
 <td>05469830001 </td>
 <td>For xCelligence impedance unit </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Luma plate 96 </td>
 <td>Perkin Elmer </td>
 <td>6005630 </td>
 <td>For measuring radioactivity in the Top Count NXT. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>xCelligence RTCA DP Station </td>
 <td>Roche Applied Science </td>
 <td>RTCA DP </td>
 <td>Impedance unit </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Top Count NXT </td>
 <td>Perkin Elmer </td>
 <td>C990601 </td>
 <td>Scintillation &amp; Luminescence Counter </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fas Ligand antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>556372</td>
 <td>For blocking Fas-Fas ligand interactions</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HLA-A2 BB7.2 antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>551230</td>
 <td>For blocking HLA class I</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mouse IgG2b, &kappa;</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555740</td>
 <td>Isotype control for HLA class I</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SKBR3 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-30</td>
 <td>Adenocarcinoma</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MCF7 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-22</td>
 <td>Adenocarcinoma</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HCC1419 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>CRL-2326</td>
 <td>Primary ductal carcinoma</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BT20 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-19</td>
 <td>Carcinoma</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

determining optimal cytotoxic activity of human her2neu specific cd8 t cells by comparing the cr51 release assay to the xcelligence system

Zytotoxische CD8 T-Zellen stellen eine Untergruppe von T-Zellen, die zur Induktion der Tod von infizierten oder malignen Wirtszellen 1 sind. Diese Zellen exprimieren einen speziellen Rezeptor, den sogenannten T-Zell-Rezeptor (TCR), der eine spezifische antigene Peptid gebunden an HLA-Klasse-I-Moleküle 2 erkennen kann. Der Eingriff der infizierten Zellen oder Tumorzellen durch ihre HLA Klasse I-Molekül resultiert in der Herstellung von lytischen Moleküle wie Granzymen und Perforin was Ziel Zelltod. Obwohl es nützlich ist, um Frequenzen von Antigen-spezifischen CD8-T-Zellen unter Verwendung von Assays, wie die ELIspot oder Durchflusszytometrie bestimmen, ist es auch nützlich, um die Stärke der CD8 T-Zell-Antworten mit Zytotoxizitätsassays 3 ermitteln. Die bekanntesten Assay zur Beurteilung zytotoxische Funktion ist die Chromfreisetzungsassay (CRA), die als ein Standard-Test 4 ist. Die CRA hat einige Einschränkungen, einschließlich Exposition von Zellen gegenüber Gammastrahlung, lack Reproduzierbarkeit und eine Anforderung für eine große Anzahl von Zellen. Im vergangenen Jahrzehnt hat es Interesse an der Einführung neuer Strategien, um diese Einschränkungen zu überwinden. Neuere Ansätze sind diejenigen, die Maßnahme Caspase Release 4, BLT Esteraseaktivität 5 und Oberflächenexpression von CD107 6. Die Impedanz-Assay, mit dem Roche XCELLIGENCE-System wurde in der vorliegenden Arbeit auf sein Potential als Alternative zu der CRA untersucht. Impedanz oder Widerstand gegen elektrischen Strom erfolgt, wenn adhärenten Tumorzellen Elektrodenplatten binden. Tumor-Zellen nach Tötung lösen und elektrische Impedanz verringert, was durch die XCELLIGENCE gemessen werden. Die Fähigkeit, die Impedanz-basierte Ansatz anzupassen Zell-vermittelte Tötung beurteilen beruht auf der Beobachtung, dass T-Zellen nicht fest haften auf den meisten Oberflächen und scheinen nicht zu viel Einfluss auf die Impedanz wodurch sich jede Sorge der direkten Beeinflussung der T-Zellen haben beidie Messung. Die Ergebnisse zeigen, dass die Impedanz-basierten Assay kann Veränderungen der Konzentrationen von Antigen-spezifischen zytotoxischen CD8-T-Zellen mit einer erhöhten Empfindlichkeit gegenüber dem Standard CRA erkennen. Basierend auf diesen Ergebnissen kann Impedanz-basierte Ansätze gute Alternativen zu Ratingagenturen oder andere Ansätze, die zytotoxische CD8 T-Zell-Funktionalität messen Ziel sein.

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Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System

Die Chromfreisetzungsassay eine gemeinsame Assay zum Nachweis zytotoxischer T-Zell-Aktivität, hat einige Einschränkungen. Mit Antigen-spezifischen CD8-T-Zellen und menschlichen Mammakarzinom Tumorzelllinie, SKBR3, die in diesem Artikel wurde ein Impedanz-Ansatz für die Fähigkeit des Erfassens Zelltötung untersucht.

Bestimmung der optimalen zytotoxische Aktivität der Menschenrechte Her2neu spezifischen CD8 T-Zellen durch Vergleich der Cr51 Freisetzungsassay dem xCELLigence-System

Cytotoxic CD8 T cells constitute a subgroup of T  cells that are capable of inducing the death of infected or malignant host  cells1. These cells express ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Methoden zur Beta Cell Death vermittelt durch zytotoxische T-Lymphozyten Beurteilung

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Forschung

Immunologie und Infektion

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

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T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

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Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Beurteilung der Innate Sensing von HIV-1-infizierten CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zellen durch Plasmazytoide Dendritische Zellen unter Verwendung eines<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Co-Kultursystem.

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Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

Automatisierte Zellanreicherung des Cytomegalovirus-spezifischen T-Zellen für die klinische Anwendung mit der Zytokin-Capture-System

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Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Entwicklung von Stammzellen abgeleiteten Antigen-spezifische regulatorische T-Zellen gegen Autoimmunität

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

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Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-spezifischen CD8<sup&gt; +</sup&gt; T-Zellen in Rhesusaffen von Peptid-MHC-I Tetramerfärbung

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-Tetramer Färbung und Quantitative Analyse zur Bestimmung der Lage, Fülle und Phänotyp der Antigen-spezifische CD8-T-Zellen in den Geweben

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Hocheffiziente Generierung von Antigen-spezifischen primären Maus-Zytotoxischen T-Zellen für Funktionstests in einem Autoimmun-Diabetes-Modell

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...