Name: determining optimal cytotoxic activity of human her2neu specific cd8 t cells by comparing the cr51 release assay to the xcelligence system
Uploaded: 2012-08-08T12:00:00
Duration: 11 min 31 s
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इस काम के इलाज फाउंडेशन और NIH / NCI, 9R01 CA152045 और P50-CA116201 के लिए सुसान जी Komen से कीथ एल Knutson को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.

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	<li>Zhang, N., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8(+)+T+cells:+foot+soldiers+of+the+immune+system.">CD8(+) T cells: foot soldiers of the immune system.</a> Immunity. 35, 161-168 (2011).</li><li>Garboczi, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+complex+between+human+T-cell+receptor,+viral+peptide+and+HLA-A2.">Structure of the complex between human T-cell receptor, viral peptide and HLA-A2.</a> Nature. 384, 134-141 (1996).</li><li>Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+analysis+of+T-cell+immunity.">Laboratory analysis of T-cell immunity.</a> Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).</li><li>Andersen, M. H., Schrama, D., Thor Straten, P., Becker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cytotoxic T cells. J. Invest. Dermatol. 126, 32-41 (2006).</li><li>Weren, A., Bonnekoh, B., Schraven, B., Gollnick, H., Ambach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+flow+cytometric+assay+focusing+on+perforin+release+mechanisms+of+cytotoxic+T+lymphocytes.">A novel flow cytometric assay focusing on perforin release mechanisms of cytotoxic T lymphocytes.</a> J. Immunol. Methods. 289, 17-26 (2004).</li><li>Aktas, E., Kucuksezer, U. C., Bilgic, S., Erten, G., Deniz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+CD107a+expression+and+cytotoxic+activity.">Relationship between CD107a expression and cytotoxic activity.</a> Cell Immunol. 254, 149-154 (2009).</li><li>Knutson, K. L., Schiffman, K., Disis, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+a+HER-2/neu+helper+peptide+vaccine+generates+HER-+2/neu+CD8+T-cell+immunity+in+cancer+patients.">Immunization with a HER-2/neu helper peptide vaccine generates HER- 2/neu CD8 T-cell immunity in cancer patients.</a> J. Clin. Invest. 107, 477-484 (2001).</li><li>Asiedu, M. K., Ingle, J. N., Behrens, M. D., Radisky, D. C., Knutson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta/TNF(alpha)-mediated+epithelial-mesenchymal+transition+generates+breast+cancer+stem+cells+with+a+claudin-low+phenotype.">TGFbeta/TNF(alpha)-mediated epithelial-mesenchymal transition generates breast cancer stem cells with a claudin-low phenotype.</a> Cancer Res. 71, 4707-4719 (2011).</li><li>Strijbosch, L. W., Buurman, W. A., Does, R. J., Zinken, P. H., Groenewegen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limiting+dilution+assays.+Experimental+design+and+statistical+analysis.">Limiting dilution assays. Experimental design and statistical analysis.</a> J. Immunol. Methods. 97, 133-140 (1987).</li><li>Gallimore, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+exhaustion+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+visualized+using+soluble+tetrameric+major+histocompatibility+complex+class+I-peptide+complexes.">Induction and exhaustion of lymphocytic choriomeningitis virus-specific cytotoxic T lymphocytes visualized using soluble tetrameric major histocompatibility complex class I-peptide complexes.</a> J. Exp. Med. 187, 1383-1393 (1998).</li></ol>

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CD8 टी कोशिकाओं को सीधे संक्रमित या घातक कोशिकाओं 4 मार करने में सक्षम किया जा रहा है, अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए महत्वपूर्ण हैं. प्रतिजन विशेष CD8 टी कोशिकाओं (जैसे ELISPOT, tetramer, प्रवाह cytometry) की संख्या को मापने के लिए कई तरीके हैं, अक्सर यह है कि इन कोशिकाओं 3 कार्यात्मक साइटोटोक्सिक हैं कि क्या पता करने के लिए उपयोगी है. साइटोटोक्सिक समारोह का आकलन करने के लिए सबसे पहचानने परख स्वर्ण मानक परख 4 माना जाता है जो सीआरए, है. सीआरए के प्रमुख सीमाओं रेडियोधर्मिता की (1) की आवश्यकता है, संवेदनशीलता की (2) कमी, यंत्रवत जानकारी की (3) अभाव, कोशिकाओं की बड़ी मात्रा के लिए (4) की आवश्यकता है, और (5) श्रमसाध्य सेट अप कर रहे हैं. इस प्रकार, पिछले एक दशक में, इन सीमाओं को कम करने के लिए नई रणनीति अपनाने में रुचि रही है. नए दृष्टिकोण शामिल उन कि उपाय कस्पासे रिहाई 4, बीएलटी esterase activity5, और CD107 6 की सतह अभिव्यक्ति. वर्तमान पांडुलिपि से पता चलता है किरॉश xCELLigence सिस्टम पर प्रदर्शन प्रतिबाधा आधारित परख,, भी सीआरए के लिए एक विकल्प के रूप में उपयोगी हो सकता है. प्रतिबाधा आधारित दृष्टिकोण के लिए अनुकूल करने की क्षमता सतहों कस पालन नहीं है जो टी कोशिकाओं, इस प्रकार की माप के साथ टी कोशिकाओं के प्रत्यक्ष हस्तक्षेप की किसी भी चिंता को कम प्रतिबाधा पर ज्यादा प्रभाव नहीं दिखाई देते हैं कि अवलोकन पर टिकी हुई है. प्रतिबाधा परख प्रणाली के उपयोग के लिए आवश्यक श्रम काफी कम मुख्य रूप से रेडियोधर्मिता के उपयोग के लिए विनियामक चिंताओं के उन्मूलन की वजह से होने की उम्मीद है. प्रतिबाधा आधारित प्रणाली का ही उल्लेखनीय दोष $ 50,000 से 60,000 डॉलर की एक परिव्यय xCELLigence इकाई की खरीद के लिए आवश्यक है. हालांकि, xCELLigence इकाई एक विकिरण काउंटर के लिए समाप्त की जरूरत है और टी सेल cytotoxicity 8 के अलावा दवाओं और प्रवास के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए उपयोगी किया जा रहा है, कहीं अधिक बहुमुखी है. कि टिप्पणियोंट्यूमर कोशिका प्रतिबाधा में कमी खुराक पर निर्भर है, के रूप में एक सरल माध्यमिक द्विघात समारोह के बाद एक यथोचित खड़ी ढलान के साथ, चित्रा 2 में दिखाया गया परख 9 साइटोटोक्सिक कोशिकाओं की आवृत्ति का अनुमान लगाने के कमजोर पड़ने assays के (LDAs) को सीमित करने में इस्तेमाल किया जा सकता है, . प्रतिबाधा आधारित दृष्टिकोण के साथ एक लाभ यह आवश्यक टी कोशिकाओं और ट्यूमर कोशिकाओं की संख्या झील प्राधिकरण संभवतः अधिक व्यावहारिक बनाने, सीआरए से भी कम है. उदाहरण के लिए, सीआरए में, एक 1:40 के अनुपात में, अच्छी तरह से प्रति 1 एक्स 10 5 ट्यूमर कोशिकाओं को अच्छी तरह से प्रति 4 एक्स 10 कुल 6 टी कोशिकाओं की आवश्यकता है जो चढ़ाया हैं. हालांकि, प्रतिबाधा आधारित परख में, अच्छी तरह से प्रति केवल 1.5 एक्स 10 4 ट्यूमर कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से केवल 6 एक्स 10 5 कुल टी कोशिकाओं की खपत है, जो आवश्यक हैं. इस प्रकार, प्रतिबाधा आधारित परख 85% कम टी कोशिकाओं और ट्यूमर कोशिकाओं का उपयोग करता है. यह कमी प्रतिबाधा आधारित प्रणाली मानव नैदानिक ​​परीक्षणों में immunologic निगरानी के लिए अनुकूलित किया जा सकता है पता चलता है कि जहां टीरक्त की वह मात्रा में सीमित हो सकता है छोड़ता है. सीआरए एक ही समय बात करने के लिए सीमित है, जबकि इसके अलावा, प्रतिबाधा आधारित परख उपयोगकर्ता न्यूनतम अतिरिक्त श्रम और कोशिकाओं के साथ ही प्रयोग पर कई lysis समय अंक की तुलना करने की अनुमति देता है, निरंतर वास्तविक समय डाटा एकत्र करता है. आवृत्ति गणना संभावित 10 कुल प्रतिजन विशेष CD8 टी कोशिकाओं को कार्यात्मक साइटोटोक्सिक टी कोशिकाओं का अनुपात स्थापित करने के लिए इस तरह के tetramer विश्लेषण के रूप में समारोह उपाय नहीं है कि अन्य रणनीतियों के साथ जोड़ा जा सकता है. प्रतिबाधा आधारित दृष्टिकोण का सबसे आकर्षक सुविधाओं में से एक सबसे अन्य assays के विपरीत, cytotoxicity संभवतः यह आसान inhibitors या एंटीबॉडी के उपयोग के साथ सेलुलर बातचीत का अध्ययन कर रही है, वास्तविक समय में निगरानी रखी जा सकता है, कि है. एक अन्य विधि लेबलिंग विरोध है कि ट्यूमर कोशिकाओं के लिए उपयुक्त हो सकता है. गैर मारे ट्यूमर कोशिकाओं लेबल और नहीं रह रहे हैं क्योंकि अन्त में, बाँझ, आगे फसल और टी सेल प्रतिरोधी कोशिकाओं का अध्ययन possib हैले. दोनों प्रणालियों विशेष टी कोशिकाओं के जवाब में ट्यूमर को मारने के डेटा प्रदान करते हुए संक्षेप में, प्रतिबाधा आधारित परख सीआरए की तुलना में अधिक संवेदनशील है और एक अधिक लचीला मंच प्रदान करता है.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ficoll-Paque Plus </td>
 <td>GE Healthcare </td>
 <td>17-1440-03 </td>
 <td>Used to isolate PBMCs from blood </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI 1640 </td>
 <td>Cellgro </td>
 <td>10-040-CV </td>
 <td>Cell culture media </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FBS </td>
 <td>Denville Scientific </td>
 <td>FB5001-H </td>
 <td>Cell culture media </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human IL-2 </td>
 <td>eBioscience </td>
 <td>14-8029-81 </td>
 <td>For stimulating growth of T cells </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human Interferon gamma </td>
 <td>Cell Sciences </td>
 <td>CR2026 </td>
 <td>For stimulating MHC expression in tumor cells </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HER-2/neu p369-377 peptide </td>
 <td>Mayo Clinic peptide synthesis core </td>
 <td>amino acid sequence KIFGSLAFL </td>
 <td>Binds to HLA-A2 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Influenza p58-66 peptide </td>
 <td>Mayo Clinic peptide synthesis core </td>
 <td>amino acid sequence GILGFVFTL </td>
 <td>Binds to HLA-A2 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human CD3/CD28 Dynabeads </td>
 <td>Invitrogen </td>
 <td>111-61D </td>
 <td>For non-specific T cell activation and expansion </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chromium-51 </td>
 <td>MP Biomedicals </td>
 <td>62015 </td>
 <td>CRA labeling reagent </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E-plate </td>
 <td>Roche Applied Science </td>
 <td>05469830001 </td>
 <td>For xCelligence impedance unit </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Luma plate 96 </td>
 <td>Perkin Elmer </td>
 <td>6005630 </td>
 <td>For measuring radioactivity in the Top Count NXT. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>xCelligence RTCA DP Station </td>
 <td>Roche Applied Science </td>
 <td>RTCA DP </td>
 <td>Impedance unit </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Top Count NXT </td>
 <td>Perkin Elmer </td>
 <td>C990601 </td>
 <td>Scintillation &amp; Luminescence Counter </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fas Ligand antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>556372</td>
 <td>For blocking Fas-Fas ligand interactions</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HLA-A2 BB7.2 antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>551230</td>
 <td>For blocking HLA class I</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mouse IgG2b, &kappa;</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555740</td>
 <td>Isotype control for HLA class I</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SKBR3 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-30</td>
 <td>Adenocarcinoma</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MCF7 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-22</td>
 <td>Adenocarcinoma</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HCC1419 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>CRL-2326</td>
 <td>Primary ductal carcinoma</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BT20 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-19</td>
 <td>Carcinoma</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

determining optimal cytotoxic activity of human her2neu specific cd8 t cells by comparing the cr51 release assay to the xcelligence system

Cytotoxic CD8 T cells constitute a subgroup of T cells that are capable of inducing the death of infected or malignant host cells1. These cells express a specialized receptor, called the T cell receptor (TCR), which can recognize a specific antigenic peptide bound to HLA class I molecules2. Engagement of infected cells or tumor cells through their HLA class I molecule results in production of lytic molecules such as granzymes and perforin resulting in target cell death. While it is useful to determine frequencies of antigen-specific CD8 T cells using assays such as the ELIspot or flow cytometry, it is also helpful to ascertain the strength of CD8 T cell responses using cytotoxicity assays3. The most recognizable assay for assessing cytotoxic function is the Chromium Release Assay (CRA), which is considered a standard assay 4. The CRA has several limitations, including exposure of cells to gamma radiation, lack of reproducibility, and a requirement for large numbers of cells. Over the past decade, there has been interest in adopting new strategies to overcome these limitations. Newer approaches include those that measure caspase 
release 4, BLT esterase activity 5 and surface expression of CD107 6. The impedance-based assay, using the Roche xCelligence system, was examined in the present paper for its potential as an alternative to the CRA. Impedance or opposition to an electric current occurs when adherent tumor cells bind to electrode plates. Tumor cells detach following killing and electrical impedance is reduced which can be measured by the xCelligence system. The ability to adapt the impedance-based approach to assess cell-mediated killing rests on the observation that T cells do not adhere tightly to most surfaces and do not appear to have much impact on impedance thus diminishing any concern of direct interference of the T cells with the measurement. Results show that the impedance-based assay can detect changes in the levels of antigen-specific cytotoxic CD8 T cells with increased sensitivity relative to the standard CRA. Based on these results, impedance-based approaches may be good alternatives to CRAs or other approaches that aim to measure cytotoxic CD8 T cell functionality.

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Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System

क्रोमियम रिहाई परख, साइटोटोक्सिक टी सेल गतिविधि का पता लगाने के लिए एक आम परख, कई सीमाएं हैं. वर्तमान अनुच्छेद में, प्रतिजन विशेष CD8 टी कोशिकाओं और मानव स्तन कैंसर ट्यूमर लाइन, SKBR3 का उपयोग करना, एक प्रतिबाधा आधारित दृष्टिकोण सेल हत्या का पता लगाने की क्षमता के लिए जांच की गई थी.

XCELLigence सिस्टम को Cr51 रिलीज परख तुलना द्वारा मानव Her2neu विशिष्ट CD8 टी कोशिकाओं के इष्टतम साइटोटोक्सिक गतिविधि निर्धारण

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