Name: determining optimal cytotoxic activity of human her2neu specific cd8 t cells by comparing the cr51 release assay to the xcelligence system
Uploaded: 2012-08-08T12:00:00
Duration: 11 min 31 s
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	<li>Zhang, N., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8(+)+T+cells:+foot+soldiers+of+the+immune+system.">CD8(+) T cells: foot soldiers of the immune system.</a> Immunity. 35, 161-168 (2011).</li><li>Garboczi, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+complex+between+human+T-cell+receptor,+viral+peptide+and+HLA-A2.">Structure of the complex between human T-cell receptor, viral peptide and HLA-A2.</a> Nature. 384, 134-141 (1996).</li><li>Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+analysis+of+T-cell+immunity.">Laboratory analysis of T-cell immunity.</a> Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).</li><li>Andersen, M. H., Schrama, D., Thor Straten, P., Becker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cytotoxic T cells. J. Invest. Dermatol. 126, 32-41 (2006).</li><li>Weren, A., Bonnekoh, B., Schraven, B., Gollnick, H., Ambach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+flow+cytometric+assay+focusing+on+perforin+release+mechanisms+of+cytotoxic+T+lymphocytes.">A novel flow cytometric assay focusing on perforin release mechanisms of cytotoxic T lymphocytes.</a> J. Immunol. Methods. 289, 17-26 (2004).</li><li>Aktas, E., Kucuksezer, U. C., Bilgic, S., Erten, G., Deniz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+CD107a+expression+and+cytotoxic+activity.">Relationship between CD107a expression and cytotoxic activity.</a> Cell Immunol. 254, 149-154 (2009).</li><li>Knutson, K. L., Schiffman, K., Disis, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+a+HER-2/neu+helper+peptide+vaccine+generates+HER-+2/neu+CD8+T-cell+immunity+in+cancer+patients.">Immunization with a HER-2/neu helper peptide vaccine generates HER- 2/neu CD8 T-cell immunity in cancer patients.</a> J. Clin. Invest. 107, 477-484 (2001).</li><li>Asiedu, M. K., Ingle, J. N., Behrens, M. D., Radisky, D. C., Knutson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta/TNF(alpha)-mediated+epithelial-mesenchymal+transition+generates+breast+cancer+stem+cells+with+a+claudin-low+phenotype.">TGFbeta/TNF(alpha)-mediated epithelial-mesenchymal transition generates breast cancer stem cells with a claudin-low phenotype.</a> Cancer Res. 71, 4707-4719 (2011).</li><li>Strijbosch, L. W., Buurman, W. A., Does, R. J., Zinken, P. H., Groenewegen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limiting+dilution+assays.+Experimental+design+and+statistical+analysis.">Limiting dilution assays. Experimental design and statistical analysis.</a> J. Immunol. Methods. 97, 133-140 (1987).</li><li>Gallimore, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+exhaustion+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+visualized+using+soluble+tetrameric+major+histocompatibility+complex+class+I-peptide+complexes.">Induction and exhaustion of lymphocytic choriomeningitis virus-specific cytotoxic T lymphocytes visualized using soluble tetrameric major histocompatibility complex class I-peptide complexes.</a> J. Exp. Med. 187, 1383-1393 (1998).</li></ol>

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CD8 T細胞が直接4感染または悪性細胞を殺すことができるという、適応免疫応答に重要です。抗原特異的CD8 T細胞（例えばELISPOT、テトラマー、フローサイトメトリー）の数を測定するいくつかの方法があるが、多くの場合、それは、これらの細胞が機能的に3細胞毒性であるかどうかを知ることは有用である。細胞傷害性機能を評価するための最も有名なアッセイは、ゴールドスタンダードアッセイ4みなされるCRA、です。 CRAの主な制限は、放射能の（1）の要件、感度、（2）不足、機械的な情報（3）不足している、細胞の多量のために（4）の要件、および（5）面倒なセットアップです。従って、過去十年間、これらの制限を最小限に抑えるために新たな戦略を採用するに関心があった。新しいアプローチは、それらのそのメジャーカスパーゼリリース4、BLTエステラーゼactivity5、表面CD107 6の発現を含む。現在の原稿は示唆しているロシュxCELLigenceシステム上で実行インピーダンスベースのアッセイも、CRAの代替として有用であり得る。インピーダンスベースのアプローチを適応する能力は、表面にしっかりと付着しないT細胞は、測定したT細胞の直接干渉の任意の関心を減少させるため、インピーダンスに大きな影響を持っているようには見えないという観察に基づいている。インピーダンス測定システムを使用するために必要な労力を大幅に減らす放射能の使用のための規制懸念の除去が主な原因であると予想される。インピーダンスベースのシステムの唯一の顕著な欠点は5万ドルから$ 60,000支出がエクセリジェンスユニットの購入のために必要とされることである。しかし、エクセリジェンス部は、放射線カウンタの必要性を排除し、T細胞の細胞毒性8に加えて、薬物および移行の細胞応答を評価するために有用である、はるかに汎用性があります。 その観察単純な二次関数は、次合理的に急勾配のアッセイが細胞傷害性細胞9の周波数を推定するために、限界希釈アッセイ（のLDA）で使用することができることを示唆して腫瘍細胞インピーダンスの減少は、 図2に示すように、用量依存性である。インピーダンスに基づくアプローチの一つの利点は、必要なT細胞および腫瘍細胞の数は、LDAが潜在的により実現すること、CRA未満であることである。例えば、CRAで、午前1時40分の割合で、ウェル当たり1×10 5腫瘍細胞はウェルあたり4×10 6合計T細胞を必要とするメッキです。しかし、インピーダンスベースのアッセイで、ウェルあたりわずか1.5×10 4個の腫瘍細胞がウェルあたりわずか6×10 5総T細胞を消費する、必要とされている。従って、インピーダンスに基づくアッセイは、85％より少ないT細胞および腫瘍細胞を使用する。この減少は、インピーダンスに基づくシステムは、ここで、tヒト臨床試験において免疫学的監視に適合させることができることを示唆している血描くの彼のボリュームが制限される場合があります。 CRAは、単一の時点に限定されている間も、インピーダンスに基づくアッセイは、ユーザは、最小限の追加労力と細胞と同じ実験で複数の溶解時間点を比較することができ、連続的なリアルタイムデータを収集する。周波数の計算は、潜在的に全体の抗原特異的CD8 T細胞10に機能的な細胞傷害性T細胞の比を確立するテトラマー解析などの機能を測定していない他の戦略と組み合わせることができる。インピーダンスベースのアプローチの最も魅力的な特徴の一つは、他のほとんどのアッセイとは異なり、細胞毒性が潜在的にそれが簡単阻害剤または抗体の使用による細胞の相互作用を研究すること、リアルタイムでモニターすることができる、ということである。別の方法は、ラベリングレジスト腫瘍細胞に適していることである。最後に、非殺さ腫瘍細胞を標識し、滅菌、さらに収穫のままとT細胞耐性細胞の研究はpossibているされていないので、ル。 両方のシステムが特定のT細胞に反応して腫瘍を殺すのデータを提供しながら要約すると、インピーダンスベースのアッセイは、CRAよりも敏感で、より柔軟なプラットフォームを提供します。

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ficoll-Paque Plus </td>
 <td>GE Healthcare </td>
 <td>17-1440-03 </td>
 <td>Used to isolate PBMCs from blood </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI 1640 </td>
 <td>Cellgro </td>
 <td>10-040-CV </td>
 <td>Cell culture media </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FBS </td>
 <td>Denville Scientific </td>
 <td>FB5001-H </td>
 <td>Cell culture media </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human IL-2 </td>
 <td>eBioscience </td>
 <td>14-8029-81 </td>
 <td>For stimulating growth of T cells </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human Interferon gamma </td>
 <td>Cell Sciences </td>
 <td>CR2026 </td>
 <td>For stimulating MHC expression in tumor cells </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HER-2/neu p369-377 peptide </td>
 <td>Mayo Clinic peptide synthesis core </td>
 <td>amino acid sequence KIFGSLAFL </td>
 <td>Binds to HLA-A2 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Influenza p58-66 peptide </td>
 <td>Mayo Clinic peptide synthesis core </td>
 <td>amino acid sequence GILGFVFTL </td>
 <td>Binds to HLA-A2 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human CD3/CD28 Dynabeads </td>
 <td>Invitrogen </td>
 <td>111-61D </td>
 <td>For non-specific T cell activation and expansion </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chromium-51 </td>
 <td>MP Biomedicals </td>
 <td>62015 </td>
 <td>CRA labeling reagent </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E-plate </td>
 <td>Roche Applied Science </td>
 <td>05469830001 </td>
 <td>For xCelligence impedance unit </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Luma plate 96 </td>
 <td>Perkin Elmer </td>
 <td>6005630 </td>
 <td>For measuring radioactivity in the Top Count NXT. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>xCelligence RTCA DP Station </td>
 <td>Roche Applied Science </td>
 <td>RTCA DP </td>
 <td>Impedance unit </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Top Count NXT </td>
 <td>Perkin Elmer </td>
 <td>C990601 </td>
 <td>Scintillation &amp; Luminescence Counter </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fas Ligand antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>556372</td>
 <td>For blocking Fas-Fas ligand interactions</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HLA-A2 BB7.2 antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>551230</td>
 <td>For blocking HLA class I</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mouse IgG2b, &kappa;</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555740</td>
 <td>Isotype control for HLA class I</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SKBR3 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-30</td>
 <td>Adenocarcinoma</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MCF7 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-22</td>
 <td>Adenocarcinoma</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HCC1419 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>CRL-2326</td>
 <td>Primary ductal carcinoma</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BT20 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-19</td>
 <td>Carcinoma</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

determining optimal cytotoxic activity of human her2neu specific cd8 t cells by comparing the cr51 release assay to the xcelligence system

細胞傷害性CD8 T細胞は、感染又は悪性宿主細胞1の死を誘導することができるT細胞のサブグループを構成している。これらの細胞は、I 2分子の HLAクラスに結合した特定の抗原性ペプチドを認識することができ、T細胞受容体（TCR）と呼ばれる特殊な受容体を発現する。例えば、標的細胞死をもたらすグランザイムとパーフォリンとして溶解分子の産生におけるそれらのHLAクラスI分子結果介して感染細胞または腫瘍細胞の係。そのようなELISPOTまたはフローサイトメトリーなどのアッセイを用いて抗原特異的CD8 T細胞の頻度を決定することは有用であるが、それは細胞毒性アッセイ3を用いてCD8 T細胞応答の強度を確認するためにも有用である。細胞傷害性機能を評価するための最も有名なアッセイは、標準アッセイ4みなされるクロム放出アッセイ（CRA）、です。 CRAは、ガンマ放射線、lの細胞の曝露を含むいくつかの制限を有している再現性の確認応答、および多数の細胞のための要件。過去10年間で、これらの制限を克服するための新たな戦略を採用することに関心があった。新しいアプローチは、それらのそのメジャーカスパーゼリリース4、BLTのエステラーゼ活性5およびCD107 6の表面発現を含む。ロシュxCELLigenceシステムを用いたインピーダンスベースのアッセイは、CRAの代替としての可能性のために本論文​​で検討した。付着腫瘍細胞が電極板に結合したときの電流に対するインピーダンスまたは反対が発生します。腫瘍細胞は死滅し、次の電気インピーダンスを切り離しxCELLigenceシステムによって測定することができる低減される。細胞媒介性死滅を評価するために、インピーダンスベースのアプローチを適応する能力は、T細胞は、ほとんどの表面に強固に付着せず、従って、T細胞の直接干渉の任意の懸念を減少インピーダンスに大きな影響を持っているようには見えないという観察に基づいているととも​​に測定。結果は、インピーダンスに基づくアッセイは、標準CRAに対して増加した感度で抗原特異的細胞傷害性CD8 T細胞のレベルの変化を検出することができることを示している。これらの結果に基づいて、インピーダンスベースのアプローチは、細胞傷害性CD8 T細胞の機能を測定することを目的とCRAの又は他のアプローチへの良好な代替物とすることができる。

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Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System

クロム放出アッセイ、細胞傷害性T細胞活性を検出するための一般的なアッセイは、いくつかの制限を有する。抗原特異的CD8 T細胞およびヒト乳癌腫瘍ライン、SKBR3を用いて、本資料では、インピーダンスベースのアプローチは、細胞死滅を検出する能力を調べた。

xCELLigenceシステムにCR51リリースアッセイを比較することによって、人間Her2neu特異的CD8 T細胞の最適な細胞傷害活性を決定する

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