Name: determining optimal cytotoxic activity of human her2neu specific cd8 t cells by comparing the cr51 release assay to the xcelligence system
Uploaded: 2012-08-08T12:00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами для Кейт Л. Knutson от Сьюзен Г. Комен для Лечения фонда и NIH / NCI 9R01 CA152045 и P50-CA116201.

<ol>
	<li>Zhang, N., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8(+)+T+cells:+foot+soldiers+of+the+immune+system.">CD8(+) T cells: foot soldiers of the immune system.</a> Immunity. 35, 161-168 (2011).</li><li>Garboczi, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+complex+between+human+T-cell+receptor,+viral+peptide+and+HLA-A2.">Structure of the complex between human T-cell receptor, viral peptide and HLA-A2.</a> Nature. 384, 134-141 (1996).</li><li>Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+analysis+of+T-cell+immunity.">Laboratory analysis of T-cell immunity.</a> Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).</li><li>Andersen, M. H., Schrama, D., Thor Straten, P., Becker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cytotoxic T cells. J. Invest. Dermatol. 126, 32-41 (2006).</li><li>Weren, A., Bonnekoh, B., Schraven, B., Gollnick, H., Ambach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+flow+cytometric+assay+focusing+on+perforin+release+mechanisms+of+cytotoxic+T+lymphocytes.">A novel flow cytometric assay focusing on perforin release mechanisms of cytotoxic T lymphocytes.</a> J. Immunol. Methods. 289, 17-26 (2004).</li><li>Aktas, E., Kucuksezer, U. C., Bilgic, S., Erten, G., Deniz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+CD107a+expression+and+cytotoxic+activity.">Relationship between CD107a expression and cytotoxic activity.</a> Cell Immunol. 254, 149-154 (2009).</li><li>Knutson, K. L., Schiffman, K., Disis, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+a+HER-2/neu+helper+peptide+vaccine+generates+HER-+2/neu+CD8+T-cell+immunity+in+cancer+patients.">Immunization with a HER-2/neu helper peptide vaccine generates HER- 2/neu CD8 T-cell immunity in cancer patients.</a> J. Clin. Invest. 107, 477-484 (2001).</li><li>Asiedu, M. K., Ingle, J. N., Behrens, M. D., Radisky, D. C., Knutson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta/TNF(alpha)-mediated+epithelial-mesenchymal+transition+generates+breast+cancer+stem+cells+with+a+claudin-low+phenotype.">TGFbeta/TNF(alpha)-mediated epithelial-mesenchymal transition generates breast cancer stem cells with a claudin-low phenotype.</a> Cancer Res. 71, 4707-4719 (2011).</li><li>Strijbosch, L. W., Buurman, W. A., Does, R. J., Zinken, P. H., Groenewegen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limiting+dilution+assays.+Experimental+design+and+statistical+analysis.">Limiting dilution assays. Experimental design and statistical analysis.</a> J. Immunol. Methods. 97, 133-140 (1987).</li><li>Gallimore, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+exhaustion+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+visualized+using+soluble+tetrameric+major+histocompatibility+complex+class+I-peptide+complexes.">Induction and exhaustion of lymphocytic choriomeningitis virus-specific cytotoxic T lymphocytes visualized using soluble tetrameric major histocompatibility complex class I-peptide complexes.</a> J. Exp. Med. 187, 1383-1393 (1998).</li></ol>

Производство и свободе доступа этого видео-статья спонсируется Roche Diagnostics.

CD8 Т-клетки играют важную роль в адаптивный иммунный ответ, будучи в состоянии непосредственно уничтожать зараженные или злокачественные клетки 4. Хотя Есть несколько способов измерения количества антиген-специфические Т-клетки CD8 (например ELIspot, тетрамере проточной цитометрии), часто это полезно знать, являются ли эти клетки функционально цитотоксических 3. Самый узнаваемый анализа для оценки цитотоксической функции CRA, который считается золотым стандартом 4 анализа. Основные ограничения CRA являются (1) требование о радиоактивности, (2) отсутствие чувствительности, (3) отсутствия механистической информации, (4) требование большого количества клеток, и (5) трудоемкой настройки. Таким образом, за последние десять лет, наблюдается интерес к принятию новой стратегии минимизации этих ограничений. Новые подходы включают те, которые измеряют каспазы 4 редакция, BLT эстераза activity5 и поверхностной экспрессии CD107 6. Настоящая рукопись позволяет предположить, чтоимпеданса на основе анализа, выполненный в системе xCelligence Roche, также могут быть полезны в качестве альтернативы CRA. Способность адаптироваться сопротивление подход основывается на том, что Т-клетки, которые не плотное прилегание к поверхности, кажется, не имеют большого влияния на сопротивление таким образом уменьшая любые озабоченности прямое вмешательство Т-клеток с измерением. Труда, необходимые для использования системы анализа импеданса, как ожидается, будет значительно меньше, в основном за счет ликвидации нормативных проблем для использования радиоактивности. Единственным заметным недостатком импеданс-системы является то, что затраты в размере $ 50 000 до $ 60 000 требуется для покупки xCelligence блока. Тем не менее, xCelligence устройство исключает необходимость излучение счетчик и гораздо более универсальным, полезные для оценки клеточной реакции на лекарства и миграции в дополнение к Т-клеточной цитотоксичности 8. Наблюдения, которыеуменьшение опухоли сопротивление ячейки зависит от дозы, как показано на рисунке 2, с достаточно крутой склон следуя простой вторичной квадратичной функции предполагает, что анализ может быть использован для ограничения разведения анализы (АМД), чтобы оценить частоту цитотоксических клеток 9 . Одним из преимуществ с импедансом подхода является то, что количество Т-клеток и опухолевых клеток требуется меньше СДР, что делает LDA потенциально более целесообразным. Например, в СДР, в соотношении 1:40, 1 × 10 5 опухолевых клеток на лунку в покрытием, который требует 4 × 10 6 общего Т-клеток на лунку. Однако в импеданс на основе анализа только 1,5 × 10 4 опухолевых клеток на лунку необходимо, который потребляет только 6 × 10 5 общая Т-клеток на лунку. Таким образом, импеданс на основе анализе используют на 85% меньше Т-клеток и опухолевых клеток. Это сокращение предполагает, что импеданс системы на основе могут быть адаптированы к иммунологической мониторинга в клинических испытаниях на человеке, где тон объемов забора крови может быть ограничено. Кроме того, в то время как CRA ограничивается одной точке времени, импеданс на основе анализа собирает непрерывный данных в реальном времени, что позволяет пользователю сравнивать различные моменты времени лизиса на такой же эксперимент с минимальной дополнительной рабочей силы и клеток. Частота вычисления потенциально могут быть объединены с другими стратегий, которые не соответствуют функции, такие как анализы тетрамера установить соотношение функционального цитотоксических Т-клеток к общему антиген-специфических CD8 + Т-клетки 10. Одним из наиболее привлекательных особенностей импеданс подхода является то, что, в отличие от большинства других анализов, цитотоксичность может контролироваться в режиме реального времени, потенциально облегчая изучение клеточных взаимодействий с использованием ингибиторов или антителами. Другим является то, что способ может быть пригодным для опухолевых клеток, которые сопротивляются маркировки. Наконец, так как не-убитых опухолевых клеток не помечены и остаются стерильными, далее сбор и изучение Т-клеток-устойчивых клеток является ко возможноLe. Таким образом, в то время как системы обеспечивают убивать опухолевые данных в ответ на специфические Т-клетки, импеданс на основе анализа является более чувствительным, чем CRA и обеспечивает более гибкую платформу.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ficoll-Paque Plus </td>
 <td>GE Healthcare </td>
 <td>17-1440-03 </td>
 <td>Used to isolate PBMCs from blood </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI 1640 </td>
 <td>Cellgro </td>
 <td>10-040-CV </td>
 <td>Cell culture media </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FBS </td>
 <td>Denville Scientific </td>
 <td>FB5001-H </td>
 <td>Cell culture media </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human IL-2 </td>
 <td>eBioscience </td>
 <td>14-8029-81 </td>
 <td>For stimulating growth of T cells </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human Interferon gamma </td>
 <td>Cell Sciences </td>
 <td>CR2026 </td>
 <td>For stimulating MHC expression in tumor cells </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HER-2/neu p369-377 peptide </td>
 <td>Mayo Clinic peptide synthesis core </td>
 <td>amino acid sequence KIFGSLAFL </td>
 <td>Binds to HLA-A2 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Influenza p58-66 peptide </td>
 <td>Mayo Clinic peptide synthesis core </td>
 <td>amino acid sequence GILGFVFTL </td>
 <td>Binds to HLA-A2 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human CD3/CD28 Dynabeads </td>
 <td>Invitrogen </td>
 <td>111-61D </td>
 <td>For non-specific T cell activation and expansion </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chromium-51 </td>
 <td>MP Biomedicals </td>
 <td>62015 </td>
 <td>CRA labeling reagent </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E-plate </td>
 <td>Roche Applied Science </td>
 <td>05469830001 </td>
 <td>For xCelligence impedance unit </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Luma plate 96 </td>
 <td>Perkin Elmer </td>
 <td>6005630 </td>
 <td>For measuring radioactivity in the Top Count NXT. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>xCelligence RTCA DP Station </td>
 <td>Roche Applied Science </td>
 <td>RTCA DP </td>
 <td>Impedance unit </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Top Count NXT </td>
 <td>Perkin Elmer </td>
 <td>C990601 </td>
 <td>Scintillation &amp; Luminescence Counter </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fas Ligand antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>556372</td>
 <td>For blocking Fas-Fas ligand interactions</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HLA-A2 BB7.2 antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>551230</td>
 <td>For blocking HLA class I</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mouse IgG2b, &kappa;</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555740</td>
 <td>Isotype control for HLA class I</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SKBR3 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-30</td>
 <td>Adenocarcinoma</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MCF7 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-22</td>
 <td>Adenocarcinoma</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HCC1419 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>CRL-2326</td>
 <td>Primary ductal carcinoma</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BT20 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-19</td>
 <td>Carcinoma</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

determining optimal cytotoxic activity of human her2neu specific cd8 t cells by comparing the cr51 release assay to the xcelligence system

Цитотоксические Т-клетки CD8 представляют собой подгруппы Т-клеток, которые способны индуцировать гибель инфицированных или злокачественных клетках-хозяевах 1. Эти клетки экспрессируют рецептор специализированные, называемый Т-клеточного рецептора (TCR), которые могут распознавать определенный антигенный пептид связан с HLA класса I молекул 2. Привлечение инфицированные клетки или опухолевые клетки через их HLA класса I молекул приводит к образованию литические молекулы, такие как гранзимы и перфорин в результате целевой клеточной смерти. Хотя это полезно для определения частоты антиген-специфических CD8 Т-клеток с помощью анализов, таких как цитометрии ELIspot или поток, это также полезно установить силу CD8 Т-клеточные ответы использованием цитотоксичности 3. Самый узнаваемый анализа для оценки цитотоксической функции анализа высвобождения хрома (CRA), который считается стандартным 4 анализа. CRA имеет ряд ограничений, в том числе воздействия на клетки гамма-излучение, лACK воспроизводимости и потребность в большом количестве клеток. За последние десять лет, наблюдается интерес к принятию новой стратегии для преодоления этих ограничений. Новые подходы включают те, которые измеряют каспазы 4 редакция, BLT эстеразная активность 5 и поверхностной экспрессии CD107 6. Импеданса на основе анализа, с использованием системы Roche xCelligence, был рассмотрен в настоящей работе для его потенциал в качестве альтернативы CRA. Сопротивление или противодействие на электрический ток возникает, когда прилипшие клетки опухоли связываются с электродными пластинами. Опухолевые клетки отделяются после умерщвления и электрическое сопротивление уменьшается, что может быть измерено xCelligence системы. Способность адаптироваться сопротивление подход к оценке клеточного убийства лежит на том, что Т-клетки не плотное прилегание к большинству поверхностей и, кажется, не имеют большого влияния на сопротивление таким образом уменьшая любое беспокойство прямого вмешательства Т-клеток сизмерение. Результаты показывают, что полное сопротивление на основе анализа может обнаружить изменения в уровне антиген-специфических цитотоксических CD8 Т-клеток с повышенной чувствительностью по отношению к стандартному CRA. На основании этих результатов, сопротивление подходов может быть хорошей альтернативой для CRAs или другие подходы, которые направлены на измерение CD8 цитотоксических Т-клеток функциональности.

Watch this Scientific Journal Video about Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System at JoVE.com

Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System

Анализ высвобождения хрома, общий тест для обнаружения цитотоксических Т-клеточной активности, имеет ряд ограничений. Использование антиген-специфические CD8 Т-клеток и рака молочной железы человека линии опухоли, SKBR3, в настоящей статье, импеданс подхода исследовали на возможность обнаружения гибели клеток.

Определение оптимальной цитотоксической активности человека Her2neu специфических CD8 Т-клеток путем сравнения CR51 анализа высвобождения в системе xCELLigence

Cytotoxic CD8 T cells constitute a subgroup of T  cells that are capable of inducing the death of infected or malignant host  cells1. These cells express ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Методы оценки бета опосредованная гибель клеток от цитотоксических Т-лимфоцитов

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

Анализ in vitro для оценки влияния иммунорегуляторных Пути на ВИЧ-специфических CD4 Т-клеток эффекторной функцией

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Клеточная проточной цитометрии измерить цитотоксическую активность

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Оценка Врожденная зондирование инфицированных ВИЧ-1 CD4<sup&gt; +</sup&gt; Т-клеток плазмоцитов дендритных клеток с помощью<em&gt; Экс естественных</em&gt; Совместное культивирование системы.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

Генерация человека Аллоантиген-специфических Т-клеток из периферической крови

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

Автоматизированная Обогащение Ячейка Цитомегаловирус-специфические Т-клетки для клинического применения с использованием системы цитокинов захвата

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Развитие стволовых клеток, полученных из антиген-специфических регуляторных Т-клеток против аутоиммунитета

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Анализ обезьяньего вируса иммунодефицита специфических CD8<sup&gt; +</sup&gt; Т-клетки в макак-резусов пептидными-MHC-I тетрамере Окрашивание

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

На месте MHC-Тетрамер окрашивание и количественный анализ для определения местоположения, изобилия и фенотип антиген специфические CD8 Т-клеток в тканях

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Высокоэффективная генерация антигена-специфических первичных мышей цитотоксических Т-клеток для функционального тестирования в модели аутоиммунного диабета

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...