Name: determining optimal cytotoxic activity of human her2neu specific cd8 t cells by comparing the cr51 release assay to the xcelligence system
Uploaded: 2012-08-08T12:00:00
Duration: 11 min 31 s
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Este trabajo fue apoyado por becas a Keith L. Knutson de la Susan G. Komen para la fundación de la curación y la NIH / NCI 9R01 CA152045 y P50-CA116201.

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	<li>Zhang, N., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8(+)+T+cells:+foot+soldiers+of+the+immune+system.">CD8(+) T cells: foot soldiers of the immune system.</a> Immunity. 35, 161-168 (2011).</li><li>Garboczi, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+complex+between+human+T-cell+receptor,+viral+peptide+and+HLA-A2.">Structure of the complex between human T-cell receptor, viral peptide and HLA-A2.</a> Nature. 384, 134-141 (1996).</li><li>Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+analysis+of+T-cell+immunity.">Laboratory analysis of T-cell immunity.</a> Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).</li><li>Andersen, M. H., Schrama, D., Thor Straten, P., Becker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cytotoxic T cells. J. Invest. Dermatol. 126, 32-41 (2006).</li><li>Weren, A., Bonnekoh, B., Schraven, B., Gollnick, H., Ambach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+flow+cytometric+assay+focusing+on+perforin+release+mechanisms+of+cytotoxic+T+lymphocytes.">A novel flow cytometric assay focusing on perforin release mechanisms of cytotoxic T lymphocytes.</a> J. Immunol. Methods. 289, 17-26 (2004).</li><li>Aktas, E., Kucuksezer, U. C., Bilgic, S., Erten, G., Deniz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+CD107a+expression+and+cytotoxic+activity.">Relationship between CD107a expression and cytotoxic activity.</a> Cell Immunol. 254, 149-154 (2009).</li><li>Knutson, K. L., Schiffman, K., Disis, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+a+HER-2/neu+helper+peptide+vaccine+generates+HER-+2/neu+CD8+T-cell+immunity+in+cancer+patients.">Immunization with a HER-2/neu helper peptide vaccine generates HER- 2/neu CD8 T-cell immunity in cancer patients.</a> J. Clin. Invest. 107, 477-484 (2001).</li><li>Asiedu, M. K., Ingle, J. N., Behrens, M. D., Radisky, D. C., Knutson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta/TNF(alpha)-mediated+epithelial-mesenchymal+transition+generates+breast+cancer+stem+cells+with+a+claudin-low+phenotype.">TGFbeta/TNF(alpha)-mediated epithelial-mesenchymal transition generates breast cancer stem cells with a claudin-low phenotype.</a> Cancer Res. 71, 4707-4719 (2011).</li><li>Strijbosch, L. W., Buurman, W. A., Does, R. J., Zinken, P. H., Groenewegen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limiting+dilution+assays.+Experimental+design+and+statistical+analysis.">Limiting dilution assays. Experimental design and statistical analysis.</a> J. Immunol. Methods. 97, 133-140 (1987).</li><li>Gallimore, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+exhaustion+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+visualized+using+soluble+tetrameric+major+histocompatibility+complex+class+I-peptide+complexes.">Induction and exhaustion of lymphocytic choriomeningitis virus-specific cytotoxic T lymphocytes visualized using soluble tetrameric major histocompatibility complex class I-peptide complexes.</a> J. Exp. Med. 187, 1383-1393 (1998).</li></ol>

Producción y acceso gratuito de este video-artículo es patrocinado por Roche Diagnostics.

Células T CD8 son importantes para la respuesta inmune adaptativa, siendo capaz de matar directamente las células infectadas o malignas 4. Mientras que hay varias maneras de medir el número de antígenos específicos de células T CD8 (por ejemplo, ELIspot, tetrámero, citometría de flujo), a menudo es útil saber si estas células son funcionalmente citotóxica 3. El ensayo más reconocible para evaluar la función citotóxica es la CRA, que se considera el ensayo estándar de oro 4. Las principales limitaciones de la CRA son (1) el requisito de radiactividad, (2) la falta de sensibilidad, (3) la falta de información sobre el mecanismo, (4) requisito de grandes cantidades de células, y (5) conjunto laborioso arriba. Así, en la última década, ha habido un interés en la adopción de nuevas estrategias para minimizar estas limitaciones. Fecha enfoques son los que miden la caspasa release 4, BLT esterasa activity5 y expresión en la superficie de CD107 6. La presente manuscrito sugiere queel ensayo basado en impedancia, realizado en el sistema xCELLigence Roche, también puede ser útil como una alternativa a la CRA. La capacidad de adaptar el enfoque basado en impedancia se basa en la observación de que las células T, que no se adhieren fuertemente a las superficies, no parece tener mucho impacto en la impedancia disminuyendo así cualquier preocupación de la interferencia directa de las células T con la medición. Se espera que la mano de obra necesaria para el uso del sistema de ensayo de impedancia a ser significativamente menos principalmente debido a la eliminación de las preocupaciones reguladoras para el uso de radiactividad. La única notable inconveniente del sistema basado en impedancia es que se requiere una inversión de $ 50,000 a $ 60,000 para la compra de la unidad xCELLigence. Sin embargo, la unidad de xCELLigence elimina la necesidad de un contador de radiación y es mucho más versátil, siendo útil para la evaluación de la respuesta celular a los medicamentos y la migración, además de la citotoxicidad de células T 8. Las observaciones que losla disminución en la impedancia célula tumoral es dependiente de la dosis, como se representa en la figura 2, con una pendiente bastante empinada después de una simple función cuadrática secundaria sugiere que el ensayo podría ser utilizado en ensayos de dilución limitante (LDA) para estimar la frecuencia de células citotóxicas 9 . Una de las ventajas con el enfoque basado en impedancia es que el número de células T y las células tumorales requeridos es menor que el CRA, haciendo LDA potencialmente más factible. Por ejemplo, en el CRA, en una proporción de 1:40, x 10 5 células tumorales 1 por pocillo son plateado, que requiere 4 x 10 6 Total de las células T por pocillo. Sin embargo, en el ensayo basado en impedancia, sólo se necesitan 1,5 10 4 células tumorales x por pocillo, que consume sólo 6 x 10 5 total de las células T por pocillo. Por lo tanto, el ensayo basado en impedancia usa 85% menos de células T y las células tumorales. Esta reducción sugiere que el sistema basado en impedancia podría ser adaptado a la vigilancia inmunológica en los ensayos clínicos humanos donde tél volúmenes de extracciones de sangre puede ser limitada. También, mientras que el CRA se limita a un solo punto de tiempo, el ensayo de impedancia basada recoge datos en tiempo real continuos, lo que permite al usuario comparar múltiples puntos de tiempo de lisis en el mismo experimento con un mínimo de mano de obra y las células adicional. Cálculos de frecuencia potencialmente podrían combinarse con otras estrategias que no miden la función, tales como análisis de tetrámero para establecer la relación de células T citotóxicas funcionales a antígenos específicos de las células T CD8 total de 10. Una de las características más atractivas del enfoque basado en impedancia es que, a diferencia de la mayoría de los otros ensayos, la citotoxicidad se puede controlar en tiempo real, por lo que es potencialmente más fáciles de estudiar las interacciones celulares con el uso de inhibidores o anticuerpos. Otra es que el método puede ser adecuado para las células tumorales que resisten etiquetado. Por último, puesto que las células tumorales no-muertos no están etiquetados y permanecen estériles, aún más la cosecha y el estudio de las células de células resistentes a T es posible. En resumen, si bien ambos sistemas proporcionan los datos de eliminación del tumor en respuesta a las células T específicas, el ensayo basado en impedancia es más sensible que la CRA y proporciona una plataforma más flexible.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ficoll-Paque Plus </td>
 <td>GE Healthcare </td>
 <td>17-1440-03 </td>
 <td>Used to isolate PBMCs from blood </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI 1640 </td>
 <td>Cellgro </td>
 <td>10-040-CV </td>
 <td>Cell culture media </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FBS </td>
 <td>Denville Scientific </td>
 <td>FB5001-H </td>
 <td>Cell culture media </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human IL-2 </td>
 <td>eBioscience </td>
 <td>14-8029-81 </td>
 <td>For stimulating growth of T cells </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human Interferon gamma </td>
 <td>Cell Sciences </td>
 <td>CR2026 </td>
 <td>For stimulating MHC expression in tumor cells </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HER-2/neu p369-377 peptide </td>
 <td>Mayo Clinic peptide synthesis core </td>
 <td>amino acid sequence KIFGSLAFL </td>
 <td>Binds to HLA-A2 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Influenza p58-66 peptide </td>
 <td>Mayo Clinic peptide synthesis core </td>
 <td>amino acid sequence GILGFVFTL </td>
 <td>Binds to HLA-A2 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human CD3/CD28 Dynabeads </td>
 <td>Invitrogen </td>
 <td>111-61D </td>
 <td>For non-specific T cell activation and expansion </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chromium-51 </td>
 <td>MP Biomedicals </td>
 <td>62015 </td>
 <td>CRA labeling reagent </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E-plate </td>
 <td>Roche Applied Science </td>
 <td>05469830001 </td>
 <td>For xCelligence impedance unit </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Luma plate 96 </td>
 <td>Perkin Elmer </td>
 <td>6005630 </td>
 <td>For measuring radioactivity in the Top Count NXT. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>xCelligence RTCA DP Station </td>
 <td>Roche Applied Science </td>
 <td>RTCA DP </td>
 <td>Impedance unit </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Top Count NXT </td>
 <td>Perkin Elmer </td>
 <td>C990601 </td>
 <td>Scintillation &amp; Luminescence Counter </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fas Ligand antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>556372</td>
 <td>For blocking Fas-Fas ligand interactions</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HLA-A2 BB7.2 antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>551230</td>
 <td>For blocking HLA class I</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mouse IgG2b, &kappa;</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555740</td>
 <td>Isotype control for HLA class I</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SKBR3 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-30</td>
 <td>Adenocarcinoma</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MCF7 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-22</td>
 <td>Adenocarcinoma</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HCC1419 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>CRL-2326</td>
 <td>Primary ductal carcinoma</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BT20 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-19</td>
 <td>Carcinoma</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

determining optimal cytotoxic activity of human her2neu specific cd8 t cells by comparing the cr51 release assay to the xcelligence system

Citotóxicos células T CD8 constituyen un subgrupo de células T que son capaces de inducir la muerte de las células huésped infectadas o malignas 1. Estas células expresan un receptor especializado, llamado el receptor de células T (TCR), que puede reconocer un péptido antigénico específico unido a moléculas del HLA de clase I 2. El acoplamiento de las células infectadas o las células tumorales a través de sus resultados molécula de clase I HLA en la producción de moléculas líticas tales como granzimas y perforina que resulta en la muerte de células diana. Si bien es útil para determinar las frecuencias de antígenos específicos de células T CD8 usando ensayos tales como el ELIspot o citometría de flujo, sino que también es útil para determinar la fuerza de CD8 respuestas de células T utilizando ensayos de citotoxicidad 3. El ensayo más reconocible para evaluar la función citotóxica es el ensayo de liberación de cromo (CRA), que se considera un ensayo estándar de 4. El CRA tiene varias limitaciones, incluyendo la exposición de las células a la radiación gamma, lacuse de recibo de la reproducibilidad, y un requisito para un gran número de células. Durante la última década, ha habido un interés en la adopción de nuevas estrategias para superar estas limitaciones. Fecha enfoques son los que miden la caspasa versión 4, la actividad esterasa BLT 5 y expresión en la superficie de CD107 6. El ensayo basado en impedancia, utilizando el sistema de xCELLigence Roche, fue examinado en el presente documento por su potencial como una alternativa a la CRA. Impedancia u oposición a una corriente eléctrica se produce cuando las células tumorales adherentes se unen a placas de electrodo. Las células tumorales se desprenden después de matanza y la impedancia eléctrica se reduce que se puede medir por el sistema xCELLigence. La posibilidad de adaptar el enfoque basado en impedancia para evaluar la muerte celular se basa en la observación de que las células T no se adhieren fuertemente a la mayoría de las superficies y no parece tener mucho impacto en la impedancia disminuyendo así cualquier preocupación de intervención directa de las células T conla medición. Los resultados muestran que el ensayo basado en impedancia puede detectar cambios en los niveles citotóxicos de las células T específicas de antígeno CD8 con el aumento de la sensibilidad relativa a la CRA estándar. Con base en estos resultados, los enfoques basados ​​en la impedancia pueden ser buenas alternativas a las ACC u otros enfoques que tienen como objetivo medir la funcionalidad de células T CD8 citotóxicas.

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Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System

El ensayo de liberación de cromo, un ensayo común para la detección de la actividad de células T citotóxicas, tiene varias limitaciones. El uso de células T CD8 específicas de antígeno y la línea tumoral de cáncer de mama humano, SKBR3, en el presente artículo, un enfoque basado en impedancia se examinó por la capacidad de detección de muerte celular.

La determinación óptima de la actividad citotóxica de las células T específicas Her2Neu CD8 Humanos comparando el Ensayo de liberación de Cr51 al Sistema xCELLigence

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