Name: determining optimal cytotoxic activity of human her2neu specific cd8 t cells by comparing the cr51 release assay to the xcelligence system
Uploaded: 2012-08-08T12:00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System at JoVE.com

Bu çalışma Cure Vakfı ve NIH / NCI 9R01 CA152045 ve P50-CA116201 için Susan G. Komen Keith L. Knutson için hibe tarafından desteklenmiştir.

<ol>
	<li>Zhang, N., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8(+)+T+cells:+foot+soldiers+of+the+immune+system.">CD8(+) T cells: foot soldiers of the immune system.</a> Immunity. 35, 161-168 (2011).</li><li>Garboczi, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+complex+between+human+T-cell+receptor,+viral+peptide+and+HLA-A2.">Structure of the complex between human T-cell receptor, viral peptide and HLA-A2.</a> Nature. 384, 134-141 (1996).</li><li>Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+analysis+of+T-cell+immunity.">Laboratory analysis of T-cell immunity.</a> Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).</li><li>Andersen, M. H., Schrama, D., Thor Straten, P., Becker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cytotoxic T cells. J. Invest. Dermatol. 126, 32-41 (2006).</li><li>Weren, A., Bonnekoh, B., Schraven, B., Gollnick, H., Ambach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+flow+cytometric+assay+focusing+on+perforin+release+mechanisms+of+cytotoxic+T+lymphocytes.">A novel flow cytometric assay focusing on perforin release mechanisms of cytotoxic T lymphocytes.</a> J. Immunol. Methods. 289, 17-26 (2004).</li><li>Aktas, E., Kucuksezer, U. C., Bilgic, S., Erten, G., Deniz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+CD107a+expression+and+cytotoxic+activity.">Relationship between CD107a expression and cytotoxic activity.</a> Cell Immunol. 254, 149-154 (2009).</li><li>Knutson, K. L., Schiffman, K., Disis, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+a+HER-2/neu+helper+peptide+vaccine+generates+HER-+2/neu+CD8+T-cell+immunity+in+cancer+patients.">Immunization with a HER-2/neu helper peptide vaccine generates HER- 2/neu CD8 T-cell immunity in cancer patients.</a> J. Clin. Invest. 107, 477-484 (2001).</li><li>Asiedu, M. K., Ingle, J. N., Behrens, M. D., Radisky, D. C., Knutson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta/TNF(alpha)-mediated+epithelial-mesenchymal+transition+generates+breast+cancer+stem+cells+with+a+claudin-low+phenotype.">TGFbeta/TNF(alpha)-mediated epithelial-mesenchymal transition generates breast cancer stem cells with a claudin-low phenotype.</a> Cancer Res. 71, 4707-4719 (2011).</li><li>Strijbosch, L. W., Buurman, W. A., Does, R. J., Zinken, P. H., Groenewegen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limiting+dilution+assays.+Experimental+design+and+statistical+analysis.">Limiting dilution assays. Experimental design and statistical analysis.</a> J. Immunol. Methods. 97, 133-140 (1987).</li><li>Gallimore, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+exhaustion+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+visualized+using+soluble+tetrameric+major+histocompatibility+complex+class+I-peptide+complexes.">Induction and exhaustion of lymphocytic choriomeningitis virus-specific cytotoxic T lymphocytes visualized using soluble tetrameric major histocompatibility complex class I-peptide complexes.</a> J. Exp. Med. 187, 1383-1393 (1998).</li></ol>

Üretim ve bu video-makale Ücretsiz Erişim Roche Diagnostics tarafından desteklenmektedir.

CD8 T hücreleri doğrudan enfekte veya kötü huylu hücreleri 4 öldürmek için güçlü olmak, adaptif bağışıklık yanıtı için önemlidir. Antijen-spesifik CD8 T hücreleri (örneğin ELISPOT, tetramer, flow sitometri) sayısını ölçmek için çeşitli yollar olsa da, çoğu kez bu hücrelerin 3 işlevsel sitotoksik olup olmadığını bilmek yararlıdır. Sitotoksik fonksiyonu değerlendirmek için en çok tanınan testi altın standart test 4 olarak kabul edilir MKK vardır. SRA önemli sınırlamalar radyoaktivite (1) şartı, duyarlılık (2) eksikliği, mekanik bir bilgi (3) eksikliği, hücrelerin büyük miktarlarda (4) gereksinimi, ve (5) zahmetli bir dizi vardır. Böylece, son on yılda, bu sınırlamaları en aza indirmek için yeni stratejiler benimseyerek ilgi olmuştur. Yeni yaklaşımlar içeren bu ölçen kaspaz sürüm 4, BLT esteraz activity5 ve CD107 6 yüzey ifadesi. Mevcut el yazması önerirRoche XCELLigence sistemi üzerinde gerçekleştirilen empedans tabanlı tahlil, aynı zamanda CRA alternatif olarak yararlı olabilir. Empedans dayalı bir yaklaşım uyum yeteneği yüzeylere sıkıca uymayan T hücreleri, bu nedenle ölçüm ile T hücrelerinin doğrudan müdahale herhangi bir endişe azalan empedansı üzerinde çok etkisi olması görünmüyor gözlem dayanmaktadır. Empedans analiz sisteminin kullanımı için gerekli emek önemli ölçüde daha az öncelikli radyoaktivite kullanımı için düzenleme ile ilgilidir ortadan kaldırılmasına bağlı olduğu tahmin edilmektedir. Empedans-tabanlı sistemin tek önemli dezavantajı $ 50.000 $ 60.000 bir harcama XCELLigence biriminin satın almak için gerekli olmasıdır. Bununla birlikte, bir birim XCELLigence radyasyon sayacı ihtiyacını ortadan kaldırır ve T hücre sitotoksisite 8 ek olarak, ilaç ve göç hücresel cevabı değerlendirmek için yararlı olan, çok yönlüdür. Bu gözlemlertümör hücre empedans doza bağımlı azalma, hem basit bir ikincil dereceden fonksiyon aşağıdaki oldukça dik bir eğim ile, Şekil 2 &#39;de gösterilen deney 9 sitotoksik hücrelerin sıklığı tahmin etmek için seyreltme tahlilleri (LDAS) sınırlayıcı kullanılan düşündürmektedir . Empedans tabanlı yaklaşım bir avantajı, gerekli T hücreleri ve tümör hücre sayısı LDA potansiyel olarak daha uygun hale CRA daha az olmasıdır. Örneğin, CRA, bir 01:40 oranında, oyuk başına 1 x 10 5 tümör hücreleri, oyuk başına 4 x 10 6 toplam T hücre gerektiren kaplama vardır. Bununla birlikte, empedans bazlı tahlilde, oyuk başına sadece 1.5 x 10 4 tümör hücreleri, oyuk başına sadece 6 x 10 5 toplam T hücreleri tüketir, ihtiyaç vardır. Bu nedenle, empedans bazlı tahlil% 85 daha az T hücreleri ve tümör hücreleri kullanır. Bu azalma, empedans tabanlı sistemi, insan klinik denemelerinde immünolojik izleme adapte edilebileceğini göstermektedir nerede tkan O sınırlı olabilir çizer. MKK tek bir zaman noktasında sınırlı iken Ayrıca, empedans bazlı analiz kullanıcı minimum ek emek ve hücreleri ile aynı deneyi birden fazla parçalama zaman noktalarında karşılaştırmak için izin, sürekli gerçek zamanlı veri toplar. Frekans hesaplamalar potansiyel olarak toplam 10 antijene spesifik CD8 T hücrelerinin fonksiyonel sitotoksik T hücrelerinin oranını belirlemek için örneğin tetramer analizleri fonksiyonu ölçmek olmayan diğer stratejiler ile kombine edilebilir. Empedans tabanlı yaklaşımın en çekici özelliklerinden biri çoğu diğer testlerin aksine, sitotoksisite potansiyel olarak daha kolay inhibitörleri veya antikorların kullanımı ile hücresel etkileşimleri çalışmak için yapım, gerçek zamanlı olarak izlenebilir olmasıdır. Başka bir yöntem, etiketleme karşı tümör hücreleri için uygun olmasıdır. Non-tümör hücreleri öldüren etiketlenmiş ve kalır çünkü Son olarak, steril, daha fazla hasat ve T-hücre-dirençli hücreler çalışma possib olduğule. Her iki sistem spesifik T hücreleri yanıt olarak tümör öldürme veri sağlamak Özetle,, empedans bazlı analiz MKK daha duyarlı ve daha esnek bir platform sağlar.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ficoll-Paque Plus </td>
 <td>GE Healthcare </td>
 <td>17-1440-03 </td>
 <td>Used to isolate PBMCs from blood </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI 1640 </td>
 <td>Cellgro </td>
 <td>10-040-CV </td>
 <td>Cell culture media </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FBS </td>
 <td>Denville Scientific </td>
 <td>FB5001-H </td>
 <td>Cell culture media </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human IL-2 </td>
 <td>eBioscience </td>
 <td>14-8029-81 </td>
 <td>For stimulating growth of T cells </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human Interferon gamma </td>
 <td>Cell Sciences </td>
 <td>CR2026 </td>
 <td>For stimulating MHC expression in tumor cells </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HER-2/neu p369-377 peptide </td>
 <td>Mayo Clinic peptide synthesis core </td>
 <td>amino acid sequence KIFGSLAFL </td>
 <td>Binds to HLA-A2 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Influenza p58-66 peptide </td>
 <td>Mayo Clinic peptide synthesis core </td>
 <td>amino acid sequence GILGFVFTL </td>
 <td>Binds to HLA-A2 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human CD3/CD28 Dynabeads </td>
 <td>Invitrogen </td>
 <td>111-61D </td>
 <td>For non-specific T cell activation and expansion </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chromium-51 </td>
 <td>MP Biomedicals </td>
 <td>62015 </td>
 <td>CRA labeling reagent </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E-plate </td>
 <td>Roche Applied Science </td>
 <td>05469830001 </td>
 <td>For xCelligence impedance unit </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Luma plate 96 </td>
 <td>Perkin Elmer </td>
 <td>6005630 </td>
 <td>For measuring radioactivity in the Top Count NXT. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>xCelligence RTCA DP Station </td>
 <td>Roche Applied Science </td>
 <td>RTCA DP </td>
 <td>Impedance unit </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Top Count NXT </td>
 <td>Perkin Elmer </td>
 <td>C990601 </td>
 <td>Scintillation &amp; Luminescence Counter </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fas Ligand antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>556372</td>
 <td>For blocking Fas-Fas ligand interactions</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HLA-A2 BB7.2 antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>551230</td>
 <td>For blocking HLA class I</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mouse IgG2b, &kappa;</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555740</td>
 <td>Isotype control for HLA class I</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SKBR3 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-30</td>
 <td>Adenocarcinoma</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MCF7 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-22</td>
 <td>Adenocarcinoma</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HCC1419 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>CRL-2326</td>
 <td>Primary ductal carcinoma</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BT20 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-19</td>
 <td>Carcinoma</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

determining optimal cytotoxic activity of human her2neu specific cd8 t cells by comparing the cr51 release assay to the xcelligence system

Sitotoksik CD8 T hücreleri enfekte ya da kötü huylu konak hücreleri 1 ölümünü indükleme yeteneğine sahip olan T-hücrelerinin bir alt grup oluştururlar. Bu hücreler, özel bir reseptör I 2 molekülleri HLA sınıf bağlı belirli bir antijenik peptid tanıyabilir, T hücresi alıcısı (TCR), adlı ifade eder. Gibi hedef hücre ölümü ile sonuçlanan granzymes ve perforin olarak litik moleküllerin üretimi ile HLA sınıf I molekülü sonuçları ile enfekte olmuş hücreleri veya tümör hücreleri kazanılmıştır. Bu tür ELISPOT veya akış sitometri gibi tahliller kullanılarak antijen spesifik CD8 T hücrelerinin oranlarını belirlemek için yararlı olsa da, sitotoksisite deneyleri 3, CD8 T hücre yanıtları kuvvetini tespit etmek için de yararlıdır. Sitotoksik fonksiyonu değerlendirmek için en çok tanınan testi standart bir test 4 olarak kabul edilir Krom Sürüm Testi (MKK) &#39;dir. CRA gama radyasyon hücrelerin maruz kalma, l dahil olmak üzere birçok sınırlamalar vardırtekrarlanabilirlik ve hücrelerin çok sayıda için bir gereklilik ack. Geçtiğimiz on yıl içinde, bu sınırlamaları aşmak için yeni stratejiler benimseyerek ilgi olmuştur. Yeni yaklaşımlar içeren bu ölçen kaspaz sürüm 4, BLT esteraz aktivite 5 ve CD107 6 yüzey ifadesi. Roche XCELLigence sistemi kullanılarak empedans bazlı analiz, MKK alternatif olarak potansiyel için yazıda incelenmiştir. Yapışık tümör hücreleri elektrot plakaları bağlanmasına zaman empedansı ya da bir elektrik akımına karşı oluşur. Tümör hücreleri öldürme aşağıdaki ayırmak ve elektriksel direnç XCELLigence sistemi tarafından ölçülebileceği azalır. Hücre-aracılı öldürme değerlendirmek için empedans dayalı bir yaklaşım uyum yeteneği T hücreleri en yüzeylere sıkıca uymayan ve böylece T hücrelerinin doğrudan müdahale herhangi bir endişe azalan empedansı üzerinde çok etkisi olması görünmüyor gözlem dayanmaktadır ileölçme. Sonuçlar empedans tabanlı tahlil, standart MKK göre artan bir hassasiyet ile antijene özgü sitotoksik CD8 T hücrelerinin seviyelerindeki değişiklikleri tespit edebilir olduğunu göstermektedir. Bu sonuçlara dayanarak, empedans tabanlı yaklaşımlar Cras veya sitotoksik CD8 T hücre işlevselliği ölçmek amacı diğer yaklaşımlar için iyi alternatifler olabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System at JoVE.com

Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System

Krom salınım tahlili, sitotoksik T hücresi aktivitesini tespit etmek için ortak bir tahlil, bazı sınırlamalar vardır. Bu madde, antijen spesifik CD8 T hücreleri ve insan göğüs kanseri tümör hattı ile, SKBR3 kullanarak, bir empedans dayalı bir yaklaşım hücre öldürme saptama yeteneğine için incelenmiştir.

XCELLigence Sistemi Cr51 Yayın Assay Karşılaştırılması tarafından İnsan Her2neu Özgül CD8 T hücrelerinin Optimal Sitotoksik Aktivite Belirlenmesi

Cytotoxic CD8 T cells constitute a subgroup of T  cells that are capable of inducing the death of infected or malignant host  cells1. These cells express ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Sitotoksik T Lenfositler Beta Hücre Ölümü aracılığı ile değerlendirin yöntemleri

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

Vitro Testi HIV-spesifik CD4 T hücre efektör işlevi üzerinde immünoregülatör yolları etkisini değerlendirmek için

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 Enfekte CD4 Doğuştan Algılama Değerlendirilmesi<sup&gt; +</sup&gt; Bir kullanılması plazmositoid dendritik hücreler tarafından T Hücreleri<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-kültür sistemi.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

Periferik Kan İnsan alloantijen-özgü T hücrelerinin üretilmesi

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

Sitokin yakalama Sistemi kullanılarak Klinik Uygulamalar için Sitomegalovirüs özgü otomatik Hücre Zenginleştirme T hücreleri

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Otoimmünite karşı Kök Hücre türetilmiş antijen-özgü düzenleyici T hücrelerinin gelişimini

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Maymun bağışıklık eksikliği virüsüne özgü CD8 analizi<sup&gt; +</sup&gt; Peptid MHC-I tetramer boyama ile Rhesus macaque maymunlarının T-hücrelerinin

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

Situ MHC-tetramer boyama ve kantitatif fenotip antijen spesifik CD8 T hücre dokularında, bereket ve konumunu belirlemek için analiz

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Otoimmün Diyabet Modelinde Fonksiyonel Testler için Antijene Özgü Primer Fare Sitotoksik T Hücrelerinin Yüksek Verimli Üretimi

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...