Name: hybridization in situ of salivary glands, ovaries, and embryos of vector mosquitoes
Uploaded: 2012-06-28T12:00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Marika Walters for at få råd til at udvikle hybridisering in situ metoder til blødt væv og Yury Goltsev for diskussion af protokoller for hybridisering in situ af Anopheles gambiae embryoner, som efterfølgende blev tilpasset og modificeret til at udvikle protokollen beskrevet her for hybridisering i situ Aedes og Culex embryoner. Vi anerkender også nyttige anbefalinger, Adam Paré og David Kosman. Vi takker Osvaldo Marinotti for videnskabelig diskussion og redigering af protokollen teksten.

<ol>
	<li>Juhn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+mapping+of+gene+expression+in+the+salivary+glands+of+the+dengue+vector+mosquito,+Aedes+aegypti.">Spatial mapping of gene expression in the salivary glands of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti.</a> Parasit. Vectors. 4, 1 (2011).</li><li>Coleman, J., Juhn, J., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+midgut+and+salivary+glands+from+Ae.+aegypti+mosquitoes.">Dissection of midgut and salivary glands from Ae. aegypti mosquitoes.</a> J. Vis. Exp. (5), e228 (2007).</li><li>Benedict, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+Plasmodium-infected+Mosquitoes:+Salivary+Glands,+Chapter.+5.4.2.">Dissecting Plasmodium-infected Mosquitoes: Salivary Glands, Chapter. 5.4.2.</a> Methods in Anopheles Research. , (2007).</li><li>Sappington, T. W., Brown, M. R., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+analysis+of+insect+ovaries,+Chapter.+42.3.">Culture and analysis of insect ovaries, Chapter. 42.3.</a> The Molecular Biology of Insect Disease Vectors: A methods manual. , (1997).</li><li>Goltsev, Y., Hsiong, W., Lanzaro, G., Levine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+combinations+of+gap+repressors+for+common+stripes+in+Anopheles+and+Drosophila+embryos.">Different combinations of gap repressors for common stripes in Anopheles and Drosophila embryos.</a> Dev. Biol. 275, 435-446 (2004).</li><li>Benedict, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anopheles+Embryo+Fixation,+Chapter.+3.7.">Anopheles Embryo Fixation, Chapter. 3.7.</a> Methods in Anopheles Research. Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4). , (2007).</li><li>Juhn, J., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=oskar+gene+expression+in+the+vector+mosquitoes,+Anopheles+gambiae+and+Aedes+aegypti.">oskar gene expression in the vector mosquitoes, Anopheles gambiae and Aedes aegypti.</a> Insect Mol. Biol. 15, 363-372 (2006).</li><li>Juhn, J., Marinotti, O., Calvo, E., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+structure+and+expression+of+nanos+(nos)+and+oskar+(osk)+orthologues+of+the+vector+mosquito,+Culex+quinquefasciatus.">Gene structure and expression of nanos (nos) and oskar (osk) orthologues of the vector mosquito, Culex quinquefasciatus.</a> Insect Mol. Biol. 17, 545-552 (2008).</li><li>Raminani, L. N., Cupp, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Embryology+of+Aedes+aegypti+(L.)+(Diptera:+Culicidae).">Early Embryology of Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae).</a> Int. J. Insect Morphol. &#38; Embryol. 4, 517-528 (1975).</li><li>Raminani, L. N., Cupp, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryology+of+Aedes+aegypti+(L.)+(Diptera:+Culicidae):+Organogenesis.">Embryology of Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae): Organogenesis.</a> Int. J. Insect morphol. &#38; Embryol. 7, 273-296 (1978).</li><li>Ivanova-Kazas, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+development+of+Anopheles+maculipennis+Mg.">Embryonic development of Anopheles maculipennis Mg.</a> Izv. Akad. Nauk SSSR ser. Biol. 2, 140-170 (1949).</li><li>Goltsev, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+evolutionary+basis+for+drought+tolerance+of+the+Anopheles+gambiae+embryo.">Developmental and evolutionary basis for drought tolerance of the Anopheles gambiae embryo.</a> Dev. Biol. 330, 462-470 (2009).</li><li>Papatsenko, D., Levine, M., Goltsev, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clusters+of+temporal+discordances+reveal+distinct+embryonic+patterning+mechanisms+in+Drosophila+and+Anopheles.">Clusters of temporal discordances reveal distinct embryonic patterning mechanisms in Drosophila and Anopheles.</a> PLoS Biol. 9, e1000584 (2011).</li><li>Davis, C. W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+larval+embryogenesis+in+the+mosquito+Culex+fatigans+Wiedemann+(Diptera:+Culicidae)+and+the+sheep-fly+Lucilla+seriata+Meigen+(Diptera:+Calliphoridae)+I.+Description+of+embryonic+development.">A comparative study of larval embryogenesis in the mosquito Culex fatigans Wiedemann (Diptera: Culicidae) and the sheep-fly Lucilla seriata Meigen (Diptera: Calliphoridae) I. Description of embryonic development.</a> Aust. J. Zool. 15, 547-579 (1967).</li></ol>

Forfatterne har ingen oplysninger.

Den hybridisering in situ og kolorimetriske farvningsprotokol præsenteres her for hel-mount myg væv og embryoner er en nyttig teknik til lokalisering af udskrifter inden for specifikke organer og celletyper. Disse procedurer er en forbedring i forhold til vores tidligere rapporterede metoder, både i strømline omfattende vasketrin og tilførsel af yderligere tekniske detaljer og reagens kilder. I vores erfaring, at kolorimetrisk påvisning af hybridiseringssignaler overlegen i følsomhed og klarheden af ​​hybridiseringssignalet i forhold til fluorescens-baserede detektionssystemer. Desuden kolorimetrisk detektion omgår spørgsmål i forbindelse med signal forskelsbehandling i embryoner, der er iboende auto-fluorescerende. Begrænsninger detektering hybridiseringssignaler forekomme, når lav hyppighed transkripter er rettet, og baggrundsfarvning er indlysende. Forøgelse af hybridiseringshastigheden temperaturen til 65 ° C har vist sig at reducere tilbageformalede hybridiseringssignaler, men er ikke foreslået erstatning for udformning unikke målspecifikke RNA-prober. Denne protokol er blevet anvendt til at udføre hybridisering in situ af hele monterede spytkirtler Aedes aegypti og ovarier og embryoner af Anopheles gambiae, Anopheles stephensi, Ae. aegypti og Culex quinquefasciatus. Denne fremgangsmåde er også anvendelig til andre myg væv, og formodentlig de andre insekter. Desuden har vi samlet for første gang sammenlignende retningslinjer for iscenesættelsen af embryonale udvikling i tre vektor myg, Ae. aegypti, An. gambiae og Cx. fatigans. Observationer er blevet rapporteret for specifikke stammer af disse tre arter under diskrete opdrætsforhold. Det er vigtigt at bemærke, at udviklingsmæssige tidsforløbet kan variere for forskellige stammer af myggearter og under forskellige opdrætsforhold. Hybridiseringer in situ supplerer den igangværende bestræbelser på at analyze de transcriptomes af myg og andre leddyr, og kan give et bedre billede af reguleringen af ​​genekspression i disse organismer.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagenset </td><td> Firma </td><td> Katalog nummer </td><td> Kommentarer (valgfri) </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA </td><td> Ambion </td><td> AM9261 </td><td></td></tr><tr><td> 1M Tris-HCI </td><td> Ambion </td><td> AM9855G </td><td> pH 8,0, </td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> Ambion </td><td> AM9625 </td><td></td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td> Ambion </td><td> AM9763 </td><td></td></tr><tr><td> 1,5 ml mikrocentrifugerør </td><td> Ambion </td><td> AM12400 </td><td> Mindre uigennemsigtige end standard rør, hjælpemidler i at visualisere prøver </td></tr><tr><td> Deioniseret formamid </td><td> Ambion </td><td> AM9342 </td><td> Opbevaring ved 4 ° C </td></tr><tr><td> DEPC vand </td><td> Ambion </td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Ambion </td><td> AM2546 </td><td></td></tr><tr><td> 5,25% natriumhypochlorit </td><td> Austins </td><td></td><td> A-1 Brand </td></tr><tr><td> T3 RNA-polymerase-Plus </td><td> Ambion </td><td> AM2733 </td><td> Opbevaring ved -20 ° C </td></tr><tr><td> T7 RNA-polymerase </td><td> Ambion </td><td> AM2082 </td><td> Opbevaring ved -20 ° C </td></tr><tr><td> 95% ethanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC61511-0040 </td><td></td></tr><tr><td> Fisherbrand engangs polyethylen overførselspipetter </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-711-7M </td><td></td></tr><tr><td> 37% formaldehyd </td><td> Fisher Scientific </td><td> F79-500 </td><td></td></tr><tr><td> HPLC-kvalitet methanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A452-1 </td><td></td></tr><tr><td> Magnesiumchlorid </td><td> Fisher Scientific </td><td> M87-500 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope cover glas </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-542A </td><td> 18 x18 mm </td></tr><tr><td> N-heptan </td><td> Fisher Scientific </td><td> H350-1 </td><td></td></tr><tr><td> P-xylen </td><td> Fisher Scientific </td><td> O5082-500 </td><td></td></tr><tr><td> Pyrex 9-brønds Spot Plate </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-748B </td><td> 100x85 mm </td></tr><tr><td> Natriumchlorid </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC32730-0025 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumhydroxid </td><td> Fisher Scientific </td><td> SS255-1 </td><td></td></tr><tr><td> SuperFrost / Plus mikroskopobjektglas </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-15 </td><td> 25x75x1.0 mm </td></tr><tr><td> Davlyn Red Clear-liner toupee tape </td><td> Hair Direct </td><td> RED-75R12 </td><td> Poly / Skin grundmateriale 0,75 i x 12 m tape rulle </td></tr><tr><td> TOPOTA Cloning Kit til Sequening med One Shot Top10 kemisk-kompetent E. coli </td><td> Invitrogen </td><td> K457501 K457540 </td><td> 20 reaktioner 40 reaktioner </td></tr><tr><td> Sonikeret laksesperm-DNA </td><td> Invitrogen </td><td> 15632-011 </td><td> Opbevaring ved -20 ° C </td></tr><tr><td> Anti-digoxigenin-AP Fab-fragmenter </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1093274 </td><td> Opbevaring ved 4 ° C </td></tr><tr><td> DIG RNA mærkningsblandingen </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1277073 </td><td> Opbevaring ved -20 ° C </td></tr><tr><td> NBT / BCIP-stamopløsning </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1681451 </td><td> Opbevaring ved 4 ° C </td></tr><tr><td> Vestlige Blocking Reagent </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11921673001 </td><td> Opbevaring ved 4 ° C </td></tr><tr><td> Saatilene HiTech polyesternet (330,130) </td><td> Saati Print </td><td> 330,34 UO PW </td><td> 330 tråde / inch, 34 mikron tråd diameter, orange farve </td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> Sigma </td><td> G6279-1 </td><td> 70% i PBT </td></tr><tr><td> Heparin-natriumsalt </td><td> Sigma </td><td> H3393 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma </td><td> P1379-500 </td><td></td></tr><tr><td> 37% formaldehyd </td><td> Ted Pella </td><td> 18508 </td><td> 10 ml aliquots i rav ampuller </td></tr><tr><td> 16 ounce Solo Papir beholdere med låg </td><td> The Paper Company </td><td> SOLOKH16AJ8000 </td><td></td></tr><tr><td> Borosilikatglas scintillation hætteglas med uhæftede skruelåg </td><td> VWR International </td><td> 66022-128 </td><td> 20 ml ved 500 </td></tr><tr><td> Sealed Air Bubble wrap celluar polstringsmateriale </td><td> VWR International </td><td> 500018-081 </td><td> 10 fod / valse 0,188 inches tyk </td></tr><tr><td> Kylling serum </td><td></td><td></td><td> Helblod opsamles enten fra vingen vene eller ved hjertepunktur fra en juvenil kylling. Blod blev inkuberet ved 37 ° C i 1 h, indtil koagulerede og derefter anbragt på is i 30 minutter. Serummet blev opsamlet og centrifugeret ved 3000 x g i 10 min. Den resulterende supernatant (klaret serum) blev opsamlet og opbevaret ved -20 ° C indtil anvendelse. </td></tr></tbody></table> Tabel 4. Tabel af specifikke reagenser og udstyr til hybridisering in situ.

hybridization in situ of salivary glands, ovaries, and embryos of vector mosquitoes

Myg er vektorer for et bredt sæt af patogener, herunder arbovira og protozoparasitter og nematoder. Undersøgelse af udskrifter og gen-regulatorer, der er udtrykt i væv, hvor myg vært og patogen interagere og i organer involveret i reproduktion er af stor interesse for strategier til at reducere myg-bårne sygdomme transmission og forstyrre æg udvikling. En række værktøjer er blevet anvendt til at undersøge og validere den tidsmæssige og vævsspecifik regulering af genekspression. Her beskriver vi protokoller, der er blevet udviklet for at indhente geografisk information, der øger forståelsen af, hvor specifikke gener udtrykkes, og deres produkter akkumuleres. Den beskrevne protokol er blevet anvendt til at validere ekspression og bestemmelse akkumulering mønstre af transkripter i væv i forbindelse med myg-bårne patogen transmission, såsom kvindelige spytkirtler, såvel som subcellulære rum i ovarier og embryoer, der resent at myg reproduktion og udvikling. De følgende procedurer repræsenterer et optimeret metode, der forbedrer effektiviteten af ​​forskellige trin i protokollen, uden tab af målspecifikke hybridiseringssignaler. Retningslinjer for RNA-probe fremstilling er dissektion af bløde væv og den generelle procedure til fiksering og hybridisering som beskrevet i del A, mens trin specifikke for indsamling, fiksering, præ-hybridisering og hybridisering af myg embryoer er beskrevet i del B.

Watch this Scientific Journal Video about Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes at JoVE.com

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Tidsmæssige og rumlige genekspressionsanalyser har en afgørende rolle i funktionel genomforskning. Whole-mount hybridisering<em&gt; In situ</em&gt; Er nyttig til bestemmelse af lokaliseringen af ​​transkripter i væv og subcellulære rum. Her har vi skitsere en hybridisering<em&gt; In situ</em&gt; Protokol med modifikationer for specifikke målvæv i myg.

Hybridisering<em&gt; In situ</em&gt; Af spytkirtler, æggestokke og embryoner af Vector Myg

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Spyt, spytkirtel, og hæmolymfe Collection fra Ixodes scapularis Flåter

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering på mitotiske kromosomer af myg

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

En metode til måling af spytkirtel funktion i mus

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Kvantitativ fluorescens in situ-hybridisering (fisk) og immunofluorescens (IF) af specifikke genprodukter i KSHV-inficerede celler

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers

Isolering af spyt Epiteliale celler fra humane spytkirtler til in vitro-vækst som Salisfærer eller Monolayers

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualisering af Candida albicans i murine mave-tarmkanalen ved hjælp fluorescerende in situ hybridisering

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Vektor kompetence analyser på Aedes aegypti Myg ved hjælp af Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

Visualisering af SARS-CoV-2 ved hjælp af Immuno RNA-fluorescens In Situ Hybridisering

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...