Name: hybridization in situ of salivary glands, ovaries, and embryos of vector mosquitoes
Uploaded: 2012-06-28T12:00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות מריקה וולטרס עצה ב ההכלאה בפיתוח שיטות באתרו של רקמות רכות Goltsev יורי לדיון פרוטוקולים של הכלאה באתרו של עוברים gambiae אנופלס, שהיו מותאמים לאחר מכן ולשנות לפתח פרוטוקול המתואר כאן ההכלאה ב באתרו של Aedes ועוברים Culex. כמו כן, אנו מכירים המלצות מועילות שניתנו על ידי אדם לקלף ודוד קוסמן. אנו מודים אוסוולדו Marinotti לדיון מדעי עריכת טקסט בפרוטוקול.

<ol>
	<li>Juhn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+mapping+of+gene+expression+in+the+salivary+glands+of+the+dengue+vector+mosquito,+Aedes+aegypti.">Spatial mapping of gene expression in the salivary glands of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti.</a> Parasit. Vectors. 4, 1 (2011).</li><li>Coleman, J., Juhn, J., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+midgut+and+salivary+glands+from+Ae.+aegypti+mosquitoes.">Dissection of midgut and salivary glands from Ae. aegypti mosquitoes.</a> J. Vis. Exp. (5), e228 (2007).</li><li>Benedict, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+Plasmodium-infected+Mosquitoes:+Salivary+Glands,+Chapter.+5.4.2.">Dissecting Plasmodium-infected Mosquitoes: Salivary Glands, Chapter. 5.4.2.</a> Methods in Anopheles Research. , (2007).</li><li>Sappington, T. W., Brown, M. R., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+analysis+of+insect+ovaries,+Chapter.+42.3.">Culture and analysis of insect ovaries, Chapter. 42.3.</a> The Molecular Biology of Insect Disease Vectors: A methods manual. , (1997).</li><li>Goltsev, Y., Hsiong, W., Lanzaro, G., Levine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+combinations+of+gap+repressors+for+common+stripes+in+Anopheles+and+Drosophila+embryos.">Different combinations of gap repressors for common stripes in Anopheles and Drosophila embryos.</a> Dev. Biol. 275, 435-446 (2004).</li><li>Benedict, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anopheles+Embryo+Fixation,+Chapter.+3.7.">Anopheles Embryo Fixation, Chapter. 3.7.</a> Methods in Anopheles Research. Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4). , (2007).</li><li>Juhn, J., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=oskar+gene+expression+in+the+vector+mosquitoes,+Anopheles+gambiae+and+Aedes+aegypti.">oskar gene expression in the vector mosquitoes, Anopheles gambiae and Aedes aegypti.</a> Insect Mol. Biol. 15, 363-372 (2006).</li><li>Juhn, J., Marinotti, O., Calvo, E., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+structure+and+expression+of+nanos+(nos)+and+oskar+(osk)+orthologues+of+the+vector+mosquito,+Culex+quinquefasciatus.">Gene structure and expression of nanos (nos) and oskar (osk) orthologues of the vector mosquito, Culex quinquefasciatus.</a> Insect Mol. Biol. 17, 545-552 (2008).</li><li>Raminani, L. N., Cupp, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Embryology+of+Aedes+aegypti+(L.)+(Diptera:+Culicidae).">Early Embryology of Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae).</a> Int. J. Insect Morphol. &#38; Embryol. 4, 517-528 (1975).</li><li>Raminani, L. N., Cupp, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryology+of+Aedes+aegypti+(L.)+(Diptera:+Culicidae):+Organogenesis.">Embryology of Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae): Organogenesis.</a> Int. J. Insect morphol. &#38; Embryol. 7, 273-296 (1978).</li><li>Ivanova-Kazas, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+development+of+Anopheles+maculipennis+Mg.">Embryonic development of Anopheles maculipennis Mg.</a> Izv. Akad. Nauk SSSR ser. Biol. 2, 140-170 (1949).</li><li>Goltsev, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+evolutionary+basis+for+drought+tolerance+of+the+Anopheles+gambiae+embryo.">Developmental and evolutionary basis for drought tolerance of the Anopheles gambiae embryo.</a> Dev. Biol. 330, 462-470 (2009).</li><li>Papatsenko, D., Levine, M., Goltsev, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clusters+of+temporal+discordances+reveal+distinct+embryonic+patterning+mechanisms+in+Drosophila+and+Anopheles.">Clusters of temporal discordances reveal distinct embryonic patterning mechanisms in Drosophila and Anopheles.</a> PLoS Biol. 9, e1000584 (2011).</li><li>Davis, C. W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+larval+embryogenesis+in+the+mosquito+Culex+fatigans+Wiedemann+(Diptera:+Culicidae)+and+the+sheep-fly+Lucilla+seriata+Meigen+(Diptera:+Calliphoridae)+I.+Description+of+embryonic+development.">A comparative study of larval embryogenesis in the mosquito Culex fatigans Wiedemann (Diptera: Culicidae) and the sheep-fly Lucilla seriata Meigen (Diptera: Calliphoridae) I. Description of embryonic development.</a> Aust. J. Zool. 15, 547-579 (1967).</li></ol>

החוקרים אין גילויים.

ההכלאה בפרוטוקול מכתים באתרו colorimetric הציג כאן כולו הר רקמות היתושים ועוברים היא טכניקה שימושית לוקליזציה של תמלילי בתוך איברים ספציפיים סוגי תאים. נהלים אלה הם שיפור לעומת שיטות שפורסמו בעבר שלנו, הן ייעול צעדים לשטוף נרחבים ומתן פרטים טכניים נוספים ומקורות מגיב. מניסיוננו, איתור colorimetric של אותות הכלאה עדיפה ברגישות ובהירות של אות הכלאה לעומת הקרינה המבוססים על ערכות זיהוי. איתור colorimetric יתר על כן עוקף בעיות הקשורות אפליה האות עוברים, שהם מטבעם אוטומטי ניאון. מגבלות של גילוי אותות הכלאה להתרחש, כאשר נמוכה שפע תמלילי ממוקדות ולא מכתים רקע ניכר. הגדלת הטמפרטורה הכלאה עד 65 ° C נמצא לצמצם חזרההכלאה הקרקע אותות, אך אינו מהווה תחליף הציע לעיצוב ייחודי יעד ספציפיים בדיקות RNA. פרוטוקול זה נעשה שימוש כדי לבצע הכלאה באתרו של שלמה, הר בלוטות הרוק של Aedes aegypti, ושחלות ועוברים של gambiae אנופלס, אנופלס stephensi, AE. aegypti ו Culex quinquefasciatus. שיטה זו ישימה גם לרקמות יתושים אחרים, ומן הסתם אלה של חרקים אחרים. בנוסף, אנו נערך על ההנחיות הפעם הראשונה ההשוואה הזמני של ההתפתחות העוברית ב 3 וקטור יתושים, AE. aegypti,. gambiae ו Cx. fatigans. תוכן דווחו על זנים מסוימים של שלושת המינים, גידול בתנאים דיסקרטיים. חשוב לציין כי במהלך תקופה התפתחותית יכול להשתנות על זנים שונים של מין יתושים ובתנאים גידול שונים. הכלאות במוסף באתרו מתמשך המאמצים לאנהlyze את transcriptomes של יתושים פרוקי רגליים אחרים, עשויה לספק תמונה טובה יותר של רגולציה של ביטוי גנים באורגניזמים אלה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערות (לא חובה) </td></tr><tr><td> 0.5 מ &#39;EDTA </td><td> Ambion </td><td> AM9261 </td><td></td></tr><tr><td> 1M Tris-HCl </td><td> Ambion </td><td> AM9855G </td><td> pH8.0 </td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> Ambion </td><td> AM9625 </td><td></td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td> Ambion </td><td> AM9763 </td><td></td></tr><tr><td> 1.5 מ&quot;ל צינורות microfuge </td><td> Ambion </td><td> AM12400 </td><td> אטום פחות צינורות סטנדרטיים, מסייע לדמיין דגימות </td></tr><tr><td> Deionized לפוראמיד </td><td> Ambion </td><td> AM9342 </td><td> אחסון ב 4 ° C </td></tr><tr><td> DEPC מים </td><td> Ambion </td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Ambion </td><td> AM2546 </td><td></td></tr><tr><td> נתרן 5.25% hypochlorite </td><td> אוסטין של </td><td></td><td> A-1 מותג </td></tr><tr><td> RNA פולימראז T3-Plus </td><td> Ambion </td><td> AM2733 </td><td> אחסון ב -20 ° C </td></tr><tr><td> T7-RNA פולימראז </td><td> Ambion </td><td> AM2082 </td><td> אחסון ב -20 ° C </td></tr><tr><td> 95% אתנול </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> AC61511-0040 </td><td></td></tr><tr><td> Fisherbrand חד פעמיות העברת פוליאתילן בטפי להחדרת נוזלים </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 13-711-7M </td><td></td></tr><tr><td> 37% פורמלדהיד </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> F79-500 </td><td></td></tr><tr><td> HPLC כיתה מתנול </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> A452-1 </td><td></td></tr><tr><td> מגנזיום כלוריד </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> M87-500 </td><td></td></tr><tr><td> כיסוי זכוכית מיקרוסקופ </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 12-542A </td><td> 18 X18 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> N-heptane </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> H350-1 </td><td></td></tr><tr><td> P-קסילן </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> O5082-500 </td><td></td></tr><tr><td> פיירקס 9-Spot גם פלייט </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 13-748B </td><td> 100x85 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> נתרן כלורי </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> AC32730-0025 </td><td></td></tr><tr><td> נתרן הידרוקסידי </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> SS255-1 </td><td></td></tr><tr><td> Superfrost / פלוס מיקרוסקופ שקופיות </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 12-550-15 </td><td> 25x75x1.0 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> Davlyn אדום תוחם ברור, פאה קלטת </td><td> ישיר שיער </td><td> RED-75R12 </td><td> פולי / בסיס סקין חומר 0.75 ב 12 רול קלטת x yd </td></tr><tr><td> ערכת TOPOTA שיבוט של Sequening בירייה אחת Top10 כימי המוסמכת א &#39; coli </td><td> Invitrogen </td><td> K457501 K457540 </td><td> 20 תגובות 40 תגובות </td></tr><tr><td> סלמון Sonicated הזרע DNA </td><td> Invitrogen </td><td> 15632-011 </td><td> אחסון ב -20 ° C </td></tr><tr><td> נגד digoxigenin-AP Fab שברים </td><td> רוש ומדע יישומי </td><td> 1093274 </td><td> אחסון ב 4 ° C </td></tr><tr><td> DIG-RNA תיוג תמהיל </td><td> רוש ומדע יישומי </td><td> 1277073 </td><td> אחסון ב -20 ° C </td></tr><tr><td> NBT / BCIP המניות פתרון </td><td> רוש ומדע יישומי </td><td> 1681451 </td><td> אחסון ב 4 ° C </td></tr><tr><td> מגיב חסימת המערבי </td><td> רוש ומדע יישומי </td><td> 11921673001 </td><td> אחסון ב 4 ° C </td></tr><tr><td> Saatilene הייטק פוליאסטר רשת (330.130) </td><td> Saati הדפסה </td><td> 330.34 אואו PW </td><td> 330 אשכולות / אינץ, 34 חוט בקוטר מיקרון, כתום צבע </td></tr><tr><td> גליצרול </td><td> סיגמא </td><td> G6279-1 </td><td> 70% PBT </td></tr><tr><td> הפרין מלח </td><td> סיגמא </td><td> H3393 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> סיגמא </td><td> P1379-500 </td><td></td></tr><tr><td> 37% פורמלדהיד </td><td> טד פלה </td><td> 18508 </td><td> Aliquots 10 מ&quot;ל ענבר אמפולות </td></tr><tr><td> 16 גר &#39;. נייר סולו מיכלים עם מכסים </td><td> חברת נייר </td><td> SOLOKH16AJ8000 </td><td></td></tr><tr><td> ההתכה של זכוכית בורו scintillatיון בקבוקון עם מכסה בורג פנוי </td><td> VWR הבינלאומי </td><td> 66022-128 </td><td> 20 מ&quot;ל במקרה של 500 </td></tr><tr><td> אטום האוויר Bubble Wrap celluar חומר ריפוד </td><td> VWR הבינלאומי </td><td> 500018-081 </td><td> 10 מטר / גליל 0.188 אינץ&#39; עבה </td></tr><tr><td> עוף סרום </td><td></td><td></td><td> הדם נאסף כולו או מעורק הזרוע או לנקב לב של עוף צעיר. דם הודגר על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 עד קרוש והניח לאחר מכן למשך 30 דקות על הקרח. סרום נאסף centrifuged ב XG 3000 עבור 10 דקות. Supernatant וכתוצאה מכך (הבהיר סרום) נאסף ונשמר ב -20 ° C עד השימוש. </td></tr></tbody></table> לוח 4. טבלה של חומרים כימיים מסוימים וציוד הכלאה באתרו.

hybridization in situ of salivary glands, ovaries, and embryos of vector mosquitoes

יתושים הם וקטורים עבור קבוצה מגוונת של פתוגנים כולל arboviruses, טפילים protozoan ו נמטודות. תמלילי חקירת ורגולטורים גנים באים לידי ביטוי ברקמות שבהן המארח יתושים אינטראקציה הפתוגן, וגם באיברים מעורבים ברבייה הם עניין רב על אסטרטגיות להפחתת יתושים העברת מחלות ולשבש פיתוח ביצה. מספר כלים להיות מועסק ללמוד לאמת את הרגולציה הזמני רקמות מסוים של ביטוי גנים. כאן, נתאר פרוטוקולים שפותחו כדי להשיג מידע מרחבי, אשר משפר את הבנתנו בו גנים מסוימים מתבטאים ומוצריהם לצבור. פרוטוקול המתואר נעשה שימוש כדי לאמת את הביטוי ולקבוע דפוסי הצטברות של תמלילי ברקמות הקשורים שידור יתושים הפתוגן, כגון בלוטות הרוק הנשי, כמו גם תאים subcellular של השחלות של העובר, אשר מחדשמאוחר רבייה התפתחות יתושים. ההליכים הבאים מייצגים המתודולוגיה אופטימיזציה המשפר את היעילות של הפעולות השונות פרוטוקול ללא הפסד של יעד ספציפיים אותות הכלאה. הנחיות להכנת בדיקה RNA, דיסקציה של הרקמות הרכות ואת נוהל כללי של קיבעון ואת ההכלאה מתוארים חלק, ואילו צעדים ספציפיים לאיסוף, קיבעון, הכלאה טרום הכלאה של עוברים יתושים מפורטים חלק ב &#39;

Watch this Scientific Journal Video about Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes at JoVE.com

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

זמן ומרחב ביטוי ניתוח גנטי תפקיד מכריע גנומיקה תפקודית. כל הכלאה-Mount<em&gt; באתרו</em&gt; שימושי לקביעת לוקליזציה של תמלילי בתוך רקמות ותאים subcellular. כאן מתאר הכלאה<em&gt; באתרו</em&gt; פרוטוקול עם שינויים של רקמות יעד ספציפיים יתושים.

הכלאה<em&gt; באתרו</em&gt; של בלוטות הרוק, השחלות, ועוברים של וקטור יתושים

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

שילוב של הדגימה דבק קלטת מבוססי פלואורסצנטי באתרו הכלאה עבור איתור מהיר של סלמונלה על תוצרת טרייה

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

איתור של וירוסים זיהומיות מהשטח, שנאספו על ידי יתושים Assay תרבות Vero Cell

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

רוק, בלוטות הרוק, וכן אוסף Hemolymph מ קרציות קרצית Scapularis

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

פלואורני<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה על כרומוזומים mitotic של יתושים

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

שיטת המדידה של תפקוד בלוטת הרוק בעכברים

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

פלואורסצנטית כמותי באתרו היברידיזציה (דג) ו Immunofluorescence (IF) של מוצרים גנטיים ספציפיים בתאים שנדבקו KSHV

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers

בידוד של תאים אפיתל הרוק מן הרוק בלוטות האדם עבור צמיחה מחוץ לתחום כמו סאליספירות או Monolayers

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

ויזואליזציה של קנדידה אלביקנס במערכת העיכול מוריין באמצעות פלורסנט היברידיזציה באתרו

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

וקטור יכולת ניתוחים על יתושים Aedes aegypti באמצעות וירוס זיקה

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

הדמיה של SARS-CoV-2 באמצעות אימונו RNA-פלואורסצנטיות בהכלאה Situ

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...