Name: hybridization in situ of salivary glands, ovaries, and embryos of vector mosquitoes
Uploaded: 2012-06-28T12:00:00
Duration: 10 min 58 s
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Gli autori desiderano ringraziare Marika Walters per la consulenza in ibridazione in situ lo sviluppo di metodi per i tessuti molli e Goltsev Yury per la discussione di protocolli per l&#39;ibridazione in situ su embrioni Anopheles gambiae, che sono stati successivamente adattati e modificati per sviluppare il protocollo descritto qui per ibridazione in situ di Aedes e di embrioni Culex. Riconosciamo anche utili raccomandazioni fornite da Adam e David Paré Kosman. Ringraziamo Osvaldo Marinotti per la discussione scientifica e la modifica del testo del protocollo.

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	<li>Juhn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+mapping+of+gene+expression+in+the+salivary+glands+of+the+dengue+vector+mosquito,+Aedes+aegypti.">Spatial mapping of gene expression in the salivary glands of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti.</a> Parasit. Vectors. 4, 1 (2011).</li><li>Coleman, J., Juhn, J., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+midgut+and+salivary+glands+from+Ae.+aegypti+mosquitoes.">Dissection of midgut and salivary glands from Ae. aegypti mosquitoes.</a> J. Vis. Exp. (5), e228 (2007).</li><li>Benedict, M. 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Gli autori non hanno informativa.

L&#39;ibridazione in situ protocollo di colorazione e colorimetrico qui presentati per intero montaggio tessuti zanzare ed embrioni è una tecnica utile per la localizzazione di organi specifici entro trascritti e tipi di cellule. Queste procedure sono un miglioramento rispetto i nostri metodi precedentemente riportati, sia nel razionalizzare le fasi di lavaggio ampi e fornire ulteriori dettagli tecnici e le fonti dei reagenti. Nella nostra esperienza, la rilevazione colorimetrica dei segnali di ibridazione è superiore in sensibilità e la chiarezza del segnale di ibridazione rispetto a fluorescenza a base di schemi di rilevazione. Inoltre rilevamento colorimetrico elude le questioni connesse con la discriminazione del segnale in embrioni, che sono intrinsecamente auto-fluorescente. Limitazioni di rilevare segnali di ibridazione si verificano, quando a bassa abbondanza trascrizioni sono mirate e colorazione di fondo è evidente. Aumentando la temperatura di ibridazione a 65 ° C è stato trovato per ridurre indietroterra segnali di ibridazione, ma non è un sostituto suggerito per la progettazione di destinazione univoco sonde specifiche RNA. Questo protocollo è stato utilizzato per eseguire ibridazione in situ whole-mount di ghiandole salivari di Aedes aegypti, e ovaie ed embrioni di Anopheles gambiae, Anopheles stephensi, Ae. aegypti e Culex quinquefasciatus. Questo metodo è applicabile anche ad altri tessuti zanzara, e presumibilmente quelli di altri insetti. Inoltre, abbiamo compilato per la prima volta le linee guida di confronto per la messa in scena dello sviluppo embrionale in tre zanzare vettore, Ae. aegypti, An. gambiae e Cx. fatigans. Le osservazioni sono state riportate per i ceppi specifici di queste tre specie di allevamento, in condizioni discrete. È importante notare che il decorso di tempo di sviluppo può variare per i diversi ceppi di specie di zanzara e in diverse condizioni di allevamento. Ibridazioni in situ supplemento in corso sforzi per anaLyze le trascrittomi di zanzare ed altri artropodi, e può fornire un quadro migliore della regolazione dell&#39;espressione genica in questi organismi.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA </td><td> Ambion </td><td> AM9261 </td><td></td></tr><tr><td> 1M Tris-HCl </td><td> Ambion </td><td> AM9855G </td><td> pH8.0 </td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> Ambion </td><td> AM9625 </td><td></td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td> Ambion </td><td> AM9763 </td><td></td></tr><tr><td> Provette per microcentrifuga da 1,5 ml </td><td> Ambion </td><td> AM12400 </td><td> Meno opaco di tubi standard; aiuti a visualizzare campioni </td></tr><tr><td> Formammide deionizzata </td><td> Ambion </td><td> AM9342 </td><td> Conservazione a 4 ° C </td></tr><tr><td> DEPC acqua </td><td> Ambion </td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinasi K </td><td> Ambion </td><td> AM2546 </td><td></td></tr><tr><td> Ipoclorito di sodio 5,25% </td><td> Austin </td><td></td><td> A-1 Marca </td></tr><tr><td> RNA polimerasi T3-Plus </td><td> Ambion </td><td> AM2733 </td><td> Conservazione a -20 ° C </td></tr><tr><td> T7 RNA polimerasi </td><td> Ambion </td><td> AM2082 </td><td> Conservazione a -20 ° C </td></tr><tr><td> 95% etanolo </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC61511-0040 </td><td></td></tr><tr><td> FISHERBRAND usa e getta in polietilene pipette di trasferimento </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-711-7M </td><td></td></tr><tr><td> 37% formaldeide </td><td> Fisher Scientific </td><td> F79-500 </td><td></td></tr><tr><td> HPLC-grade metanolo </td><td> Fisher Scientific </td><td> A452-1 </td><td></td></tr><tr><td> Magnesio cloruro </td><td> Fisher Scientific </td><td> M87-500 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio copertura in vetro </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-542A </td><td> 18 x18 millimetri </td></tr><tr><td> N-eptano </td><td> Fisher Scientific </td><td> H350-1 </td><td></td></tr><tr><td> P-xilene </td><td> Fisher Scientific </td><td> O5082-500 </td><td></td></tr><tr><td> Pyrex 9-Spot e piastra </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-748B </td><td> 100x85 millimetri </td></tr><tr><td> Cloruro di sodio </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC32730-0025 </td><td></td></tr><tr><td> Idrossido di sodio </td><td> Fisher Scientific </td><td> SS255-1 </td><td></td></tr><tr><td> SuperFrost / Plus vetrini </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-15 </td><td> 25x75x1.0 millimetro </td></tr><tr><td> Davlyn Rosso trasparente-liner Toupee tape </td><td> Capelli diretta </td><td> RED-75R12 </td><td> Poly / base materiale della pelle in 0,75 x 12 rotolo di nastro m </td></tr><tr><td> Kit per la clonazione TOPOTA Sequening con un solo colpo Top10 chimicamente competenti E. coli </td><td> Invitrogen </td><td> K457501 K457540 </td><td> 20 reazioni 40 reazioni </td></tr><tr><td> Sonicato salmone DNA degli spermatozoi </td><td> Invitrogen </td><td> 15632-011 </td><td> Conservazione a -20 ° C </td></tr><tr><td> Anti-digossigenina-AP frammenti Fab </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1093274 </td><td> Conservazione a 4 ° C </td></tr><tr><td> DIG RNA etichettatura mix </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1277073 </td><td> Conservazione a -20 ° C </td></tr><tr><td> NBT / BCIP soluzione stock </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1681451 </td><td> Conservazione a 4 ° C </td></tr><tr><td> Occidentale Reagente Bloccante </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11921673001 </td><td> Conservazione a 4 ° C </td></tr><tr><td> Saatilene Hitech poliestere mesh (330,130) </td><td> Saati Print </td><td> 330,34 UO PW </td><td> 330 fili / cm, diametro della filettatura 34 micron, colore arancio </td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Sigma </td><td> G6279-1 </td><td> 70% in PBT </td></tr><tr><td> Sale di sodio eparina </td><td> Sigma </td><td> H3393 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma </td><td> P1379-500 </td><td></td></tr><tr><td> 37% formaldeide </td><td> Ted Pella </td><td> 18508 </td><td> Aliquote da 10 ml in fiale color ambra </td></tr><tr><td> 16 once Contenitori di carta Solo con coperchi </td><td> Il Paper Company </td><td> SOLOKH16AJ8000 </td><td></td></tr><tr><td> Vetro borosilicato scintillatfiala di ioni con tappo a vite senza legami </td><td> VWR International </td><td> 66022-128 </td><td> 20 ml di 500 caso </td></tr><tr><td> Sealed Air Bubble Wrap celluar materiale ammortizzante </td><td> VWR International </td><td> 500018-081 </td><td> 10 piedi / roll 0,188 pollici di spessore </td></tr><tr><td> Siero di pollo </td><td></td><td></td><td> Il sangue intero è stato raccolto dalla vena o ala o mediante puntura cardiaca da un pollo giovanile. Il sangue è stato incubato a 37 ° C per 1 h fino coagulata e poi poste su ghiaccio per 30 min. Il siero è stato raccolto e centrifugato a 3000 xg per 10 min. Il supernatante risultante (chiarificato siero) è stato raccolto e conservato a -20 ° C fino all&#39;uso. </td></tr></tbody></table> Tabella 4. Tabella dei reagenti e attrezzature specifiche per l&#39;ibridazione in situ.

hybridization in situ of salivary glands, ovaries, and embryos of vector mosquitoes

Le zanzare sono vettori di un insieme diversificato di agenti patogeni tra cui arbovirus, parassiti protozoi e nematodi. Indagine su trascrizioni e regolatori genici, che si espresse in tessuti in cui l&#39;host zanzara e interagiscono patogeno, e in organi coinvolti nella riproduzione di grande interesse per le strategie per ridurre trasmessa dalle zanzare trasmissione della malattia e interrompere lo sviluppo delle uova. Un certo numero di strumenti sono stati impiegati per studiare e convalidare la regolazione temporale e tessuto-specifica dell&#39;espressione genica. Qui, descriviamo protocolli che sono stati sviluppati per ottenere informazioni spaziali, che aumenta la nostra comprensione di geni specifici in cui sono espressi e loro prodotti accumulano. Il protocollo descritto è stato usato per convalidare espressione e determinare i modelli di accumulo di trascritti in tessuti correlate a dalle zanzare trasmissione del patogeno, come femmina ghiandole salivari, nonché compartimenti subcellulari di ovaie e embrioni, che ritardi per la riproduzione della zanzara e dello sviluppo. Le procedure che seguono rappresentano un metodo ottimizzato che migliora l&#39;efficienza di vari passaggi del protocollo senza perdita di bersaglio-specifici segnali di ibridazione. Linee guida per la preparazione sonda di RNA, la dissezione dei tessuti molli e procedura generale per la fissazione e l&#39;ibridazione sono descritte nella parte A, mentre i passi specifici per la raccolta, fissazione, pre-ibridazione e ibridazione di embrioni zanzare sono dettagliati nella Parte B.

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Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Temporali e spaziali analisi di espressione genica hanno un ruolo cruciale nella genomica funzionale. Whole-mount ibridazione<em&gt; In situ</em&gt; È utile per determinare la localizzazione dei trascritti all&#39;interno dei tessuti e compartimenti subcellulari. Qui delineare una ibridazione<em&gt; In situ</emProtocollo&gt; con modifiche di tessuti specifici in zanzare.

Ibridazione<em&gt; In situ</em&gt; Delle ghiandole salivari, ovaie, e gli embrioni di Vector zanzare

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