Name: hybridization in situ of salivary glands, ovaries, and embryos of vector mosquitoes
Uploaded: 2012-06-28T12:00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke Marika Walters for råd i utviklingen av hybridisering in situ metoder for myke vev og Yury Goltsev for drøfting av protokoller for hybridisering in situ av Anopheles gambiae embryoer, som senere ble tilpasset og endret for å utvikle protokollen beskrevet her for hybridisering i situ av Aedes og Culex embryoer. Vi erkjenner også nyttige anbefalinger gitt av Adam Pare og David Kosman. Vi takker Osvaldo Marinotti for vitenskapelig diskusjon og redigere protokollen teksten.

<ol>
	<li>Juhn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+mapping+of+gene+expression+in+the+salivary+glands+of+the+dengue+vector+mosquito,+Aedes+aegypti.">Spatial mapping of gene expression in the salivary glands of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti.</a> Parasit. Vectors. 4, 1 (2011).</li><li>Coleman, J., Juhn, J., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+midgut+and+salivary+glands+from+Ae.+aegypti+mosquitoes.">Dissection of midgut and salivary glands from Ae. aegypti mosquitoes.</a> J. Vis. Exp. (5), e228 (2007).</li><li>Benedict, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+Plasmodium-infected+Mosquitoes:+Salivary+Glands,+Chapter.+5.4.2.">Dissecting Plasmodium-infected Mosquitoes: Salivary Glands, Chapter. 5.4.2.</a> Methods in Anopheles Research. , (2007).</li><li>Sappington, T. W., Brown, M. R., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+analysis+of+insect+ovaries,+Chapter.+42.3.">Culture and analysis of insect ovaries, Chapter. 42.3.</a> The Molecular Biology of Insect Disease Vectors: A methods manual. , (1997).</li><li>Goltsev, Y., Hsiong, W., Lanzaro, G., Levine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+combinations+of+gap+repressors+for+common+stripes+in+Anopheles+and+Drosophila+embryos.">Different combinations of gap repressors for common stripes in Anopheles and Drosophila embryos.</a> Dev. Biol. 275, 435-446 (2004).</li><li>Benedict, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anopheles+Embryo+Fixation,+Chapter.+3.7.">Anopheles Embryo Fixation, Chapter. 3.7.</a> Methods in Anopheles Research. Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4). , (2007).</li><li>Juhn, J., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=oskar+gene+expression+in+the+vector+mosquitoes,+Anopheles+gambiae+and+Aedes+aegypti.">oskar gene expression in the vector mosquitoes, Anopheles gambiae and Aedes aegypti.</a> Insect Mol. Biol. 15, 363-372 (2006).</li><li>Juhn, J., Marinotti, O., Calvo, E., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+structure+and+expression+of+nanos+(nos)+and+oskar+(osk)+orthologues+of+the+vector+mosquito,+Culex+quinquefasciatus.">Gene structure and expression of nanos (nos) and oskar (osk) orthologues of the vector mosquito, Culex quinquefasciatus.</a> Insect Mol. Biol. 17, 545-552 (2008).</li><li>Raminani, L. N., Cupp, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Embryology+of+Aedes+aegypti+(L.)+(Diptera:+Culicidae).">Early Embryology of Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae).</a> Int. J. Insect Morphol. &#38; Embryol. 4, 517-528 (1975).</li><li>Raminani, L. N., Cupp, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryology+of+Aedes+aegypti+(L.)+(Diptera:+Culicidae):+Organogenesis.">Embryology of Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae): Organogenesis.</a> Int. J. Insect morphol. &#38; Embryol. 7, 273-296 (1978).</li><li>Ivanova-Kazas, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+development+of+Anopheles+maculipennis+Mg.">Embryonic development of Anopheles maculipennis Mg.</a> Izv. Akad. Nauk SSSR ser. Biol. 2, 140-170 (1949).</li><li>Goltsev, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+evolutionary+basis+for+drought+tolerance+of+the+Anopheles+gambiae+embryo.">Developmental and evolutionary basis for drought tolerance of the Anopheles gambiae embryo.</a> Dev. Biol. 330, 462-470 (2009).</li><li>Papatsenko, D., Levine, M., Goltsev, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clusters+of+temporal+discordances+reveal+distinct+embryonic+patterning+mechanisms+in+Drosophila+and+Anopheles.">Clusters of temporal discordances reveal distinct embryonic patterning mechanisms in Drosophila and Anopheles.</a> PLoS Biol. 9, e1000584 (2011).</li><li>Davis, C. W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+larval+embryogenesis+in+the+mosquito+Culex+fatigans+Wiedemann+(Diptera:+Culicidae)+and+the+sheep-fly+Lucilla+seriata+Meigen+(Diptera:+Calliphoridae)+I.+Description+of+embryonic+development.">A comparative study of larval embryogenesis in the mosquito Culex fatigans Wiedemann (Diptera: Culicidae) and the sheep-fly Lucilla seriata Meigen (Diptera: Calliphoridae) I. Description of embryonic development.</a> Aust. J. Zool. 15, 547-579 (1967).</li></ol>

Forfatterne har ingen avsløringer.

Den hybridisering in situ og kolorimetrisk farging protokoll presenteres her for hel-mount mygg vev og befruktede egg er en nyttig teknikk for lokalisering av vitnemål innenfor bestemte organer og celletyper. Disse prosedyrene er en forbedring over våre tidligere rapporterte metoder, både i strømlinjeforme omfattende vask skritt og gi flere tekniske detaljer og reagenser kilder. Vår erfaring er kolorimetrisk påvisning av hybridisering signaler overlegen i følsomhet og klarhet av hybridisering signal i forhold til fluorescens-basert gjenkjenning ordninger. Videre kolorimetrisk påvisning omgår problemene forbundet med signal diskriminering i embryoer, som er iboende auto-fluorescerende. Begrensninger i å oppdage hybridisering signaler oppstår, når lav overflod transkripsjoner er målrettet og bakgrunn farging er tydelig. Økning av hybridisering temperaturen til 65 ° C har vist seg å redusere tilbakebakken hybridisering signaler, men er ikke en foreslått erstatning for å designe unike target-spesifikke RNA prober. Denne protokollen har blitt brukt til å utføre hybridisering in situ av hel-mount spyttkjertler av Aedes aegypti og eggstokker og embryo av Anopheles gambiae, Anopheles stephensi, Ae. aegypti og Culex quinquefasciatus. Denne metoden er også aktuelt for andre mygg vev, og antagelig de av andre insekter. I tillegg utarbeidet vi for første gang komparative retningslinjer for iscenesettelsen av embryoutvikling i tre vektor mygg, Ae. aegypti, An. gambiae og Cx. fatigans. Observasjoner har vært rapportert for bestemte typer av disse tre artene, under diskrete oppdretter forhold. Det er viktig å merke seg at utviklingsmessige tidsforløpet kan variere for ulike stammer av myggarter og under forskjellige oppdretter forhold. Hybridizations i situ supplement pågående innsats for å analyze de transcriptomes av mygg og andre leddyr, og kan gi et bedre bilde av regulering av genuttrykk i disse organismene.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagensen </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (valgfritt) </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA </td><td> Ambion </td><td> AM9261 </td><td></td></tr><tr><td> 1M Tris-HCl </td><td> Ambion </td><td> AM9855G </td><td> pH8.0 </td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> Ambion </td><td> AM9625 </td><td></td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td> Ambion </td><td> AM9763 </td><td></td></tr><tr><td> 1,5 ml microfuge rør </td><td> Ambion </td><td> AM12400 </td><td> Mindre ugjennomsiktig enn vanlige rør, hjelpemidler i visualisering prøver </td></tr><tr><td> Avionisert formamide </td><td> Ambion </td><td> AM9342 </td><td> Lagring ved 4 ° C </td></tr><tr><td> DEPC vann </td><td> Ambion </td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Ambion </td><td> AM2546 </td><td></td></tr><tr><td> 5,25% natriumhypokloritt </td><td> Austins </td><td></td><td> A-1 Brand </td></tr><tr><td> T3 RNA Polymerase-Plus </td><td> Ambion </td><td> AM2733 </td><td> Lagring ved -20 ° C </td></tr><tr><td> T7 RNA Polymerase </td><td> Ambion </td><td> AM2082 </td><td> Lagring ved -20 ° C </td></tr><tr><td> 95% Etanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC61511-0040 </td><td></td></tr><tr><td> Fisherbrand engangs polyetylen overføre pipetter </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-711-7M </td><td></td></tr><tr><td> 37% Formaldehyd </td><td> Fisher Scientific </td><td> F79-500 </td><td></td></tr><tr><td> HPLC-grade metanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A452-1 </td><td></td></tr><tr><td> Magnesiumklorid </td><td> Fisher Scientific </td><td> M87-500 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope deksel glass </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-542A </td><td> 18 x18 mm </td></tr><tr><td> N-Heptane </td><td> Fisher Scientific </td><td> H350-1 </td><td></td></tr><tr><td> P-xylene </td><td> Fisher Scientific </td><td> O5082-500 </td><td></td></tr><tr><td> Pyrex 9-brønnen Spot Plate </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-748B </td><td> 100x85 mm </td></tr><tr><td> Natriumklorid </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC32730-0025 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumhydroksid </td><td> Fisher Scientific </td><td> SS255-1 </td><td></td></tr><tr><td> Superfrost / Plus objektglass </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-15 </td><td> 25x75x1.0 mm </td></tr><tr><td> Davlyn Red Clear-liner klærne tape </td><td> Hair Direct </td><td> RED-75R12 </td><td> Poly / Hud grunnmaterialet 0,75 x 12 m teip rull </td></tr><tr><td> TOPOTA Cloning Kit for Sequening med ett skudd 10 på topp kjemisk kompetent E. coli </td><td> Invitrogen </td><td> K457501 K457540 </td><td> 20 reaksjoner 40 reaksjoner </td></tr><tr><td> Sonicated laks sperm DNA </td><td> Invitrogen </td><td> 15632-011 </td><td> Lagring ved -20 ° C </td></tr><tr><td> Anti-digoxigenin-AP Fab fragmenter </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1093274 </td><td> Lagring ved 4 ° C </td></tr><tr><td> DIG RNA merking mix </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1277073 </td><td> Lagring ved -20 ° C </td></tr><tr><td> NBT / BCIP stamløsningen </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1681451 </td><td> Lagring ved 4 ° C </td></tr><tr><td> Vest Blokkering Reagens </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11921673001 </td><td> Lagring ved 4 ° C </td></tr><tr><td> Saatilene Hitech polyester mesh (330.130) </td><td> Saati Print </td><td> 330,34 UO PW </td><td> 330 tråder / cm, 34 micron tråd diameter, oransje farge </td></tr><tr><td> Glyserol </td><td> Sigma </td><td> G6279-1 </td><td> 70% i PBT </td></tr><tr><td> Heparinnatrium salt </td><td> Sigma </td><td> H3393 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma </td><td> P1379-500 </td><td></td></tr><tr><td> 37% Formaldehyd </td><td> Ted Pella </td><td> 18508 </td><td> 10 ml alikvoter i gult ampuller </td></tr><tr><td> 16 oz. Reiser Paper beholdere med lokk </td><td> The Paper Company </td><td> SOLOKH16AJ8000 </td><td></td></tr><tr><td> Borsilikatglass scintillation hetteglass med fristilt skrulokk </td><td> VWR International </td><td> 66022-128 </td><td> 20 ml tilfelle av 500 </td></tr><tr><td> Sealed Air Bobleplast celluar støtdempende materiale </td><td> VWR International </td><td> 500018-081 </td><td> 10 fot / rull 0,188 inches tykk </td></tr><tr><td> Kylling serum </td><td></td><td></td><td> Fullblod ble samlet inn enten fra vingen blodåre eller ved hjertestans punktering fra en juvenil kylling. Blod ble inkubert ved 37 ° C i 1 time før koagulert og deretter plassert på is i 30 min. Serum ble samlet inn og sentrifugeres ved 3000 xg i 10 min. Den resulterende supernatanten (avklares serum) ble samlet inn og lagret ved -20 ° C inntil bruk. </td></tr></tbody></table> Tabell 4. Tabell av spesifikke reagenser og utstyr for hybridisering in situ.

hybridization in situ of salivary glands, ovaries, and embryos of vector mosquitoes

Mygg er vektor for et mangfoldig sett av patogener inkludert arboviruses og protozo parasitter og nematoder. Gransking av vitnemål og gen regulatorer som er uttrykt i vev der myggen vert og patogen samhandler, og i organer involvert i reproduksjon er av stor interesse for strategier for å redusere mygg-borne smitteoverføring og forstyrre egg utvikling. En rekke verktøy er ansatt for å studere og validere timelige og vev-spesifikk regulering av genuttrykk. Her beskriver vi protokoller som er utviklet for å oppnå romlig informasjon, som øker vår forståelse av hvor spesifikke gener kommer til uttrykk og sine produkter akkumuleres. Protokollen er beskrevet har blitt brukt til å validere uttrykk og bestemme akkumulering mønstre av vitnemål i vev knyttet til mygg-patogen overføring, for eksempel kvinnelige spyttkjertler, samt subcellulære avdelinger av ovarier og befruktede egg, som resent til mygg reproduksjon og utvikling. Følgende prosedyrer representerer en optimalisert metodikk som forbedrer effektiviteten av ulike trinn i protokollen uten tap av mål-spesifikke hybridisering signaler. Retningslinjer for RNA probe forberedelse, er disseksjon av myke vev og den generelle prosedyren for fiksering og hybridisering er beskrevet i del A, mens trinn som er spesifikke for innsamling, fiksering, pre-hybridisering og hybridisering av mygg embryoer er beskrevet i del B.

Watch this Scientific Journal Video about Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes at JoVE.com

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Tidsmessige og romlig genekspresjon analyser har en avgjørende rolle i funksjonell genomforskning. Hel-mount hybridisering<em&gt; In situ</em&gt; Er nyttig for å bestemme lokalisering av vitnemål innen vev og subcellulære oppbevaringsrom. Her har vi skissere en hybridisering<em&gt; In situ</em&gt; Protokoll med modifikasjoner for spesifikke målet vev i mygg.

Hybridisering<em&gt; In situ</em&gt; Av spyttkjertler, eggstokker, og embryo av Vector Mygg

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Spytt, spyttkjertel, og Hemolymph Collection fra Ixodes Scapularis Flått

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluoriserende<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering på mitotiske kromosomer Mygg

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

En metode for måling av Salivary kjortelen funksjon i mus

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Kvantitative fluorescens in situ hybridisering (FISH) og Immunofluorescence (IF) av spesifikke Gene Products i KSHV-infiserte celler

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers

Isolering av spytt epitelceller fra Human spyttkjertler for in vitro vekst som Salispheres eller Monolagere

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualisering av Candida albicans i murine mage-tarmkanalen ved hjelp av fluorescerende in situ hybridisering

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Vector Kompetanse Analyser på Aedes aegypti Mygg ved hjelp av Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

Visualisering av SARS-CoV-2 ved hjelp av Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...