Name: hybridization in situ of salivary glands, ovaries, and embryos of vector mosquitoes
Uploaded: 2012-06-28T12:00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить Марика Уолтерс за советом в развивающихся гибридизации на месте методы мягких тканей и Юрий Гольцев для обсуждения протоколов для гибридизации на месте от Anopheles gambiae эмбрионов, которые впоследствии были адаптированы и изменены, чтобы разработать протокол описанный здесь для гибридизации месте из Aedes и Culex эмбрионов. Мы также признаем, полезные советы, даваемые Адам Паре и Дэвид Косман. Мы благодарим Освальдо Marinotti для научного обсуждения и редактирования текста протокола.

<ol>
	<li>Juhn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+mapping+of+gene+expression+in+the+salivary+glands+of+the+dengue+vector+mosquito,+Aedes+aegypti.">Spatial mapping of gene expression in the salivary glands of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti.</a> Parasit. Vectors. 4, 1 (2011).</li><li>Coleman, J., Juhn, J., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+midgut+and+salivary+glands+from+Ae.+aegypti+mosquitoes.">Dissection of midgut and salivary glands from Ae. aegypti mosquitoes.</a> J. Vis. Exp. (5), e228 (2007).</li><li>Benedict, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+Plasmodium-infected+Mosquitoes:+Salivary+Glands,+Chapter.+5.4.2.">Dissecting Plasmodium-infected Mosquitoes: Salivary Glands, Chapter. 5.4.2.</a> Methods in Anopheles Research. , (2007).</li><li>Sappington, T. W., Brown, M. R., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+analysis+of+insect+ovaries,+Chapter.+42.3.">Culture and analysis of insect ovaries, Chapter. 42.3.</a> The Molecular Biology of Insect Disease Vectors: A methods manual. , (1997).</li><li>Goltsev, Y., Hsiong, W., Lanzaro, G., Levine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+combinations+of+gap+repressors+for+common+stripes+in+Anopheles+and+Drosophila+embryos.">Different combinations of gap repressors for common stripes in Anopheles and Drosophila embryos.</a> Dev. Biol. 275, 435-446 (2004).</li><li>Benedict, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anopheles+Embryo+Fixation,+Chapter.+3.7.">Anopheles Embryo Fixation, Chapter. 3.7.</a> Methods in Anopheles Research. Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4). , (2007).</li><li>Juhn, J., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=oskar+gene+expression+in+the+vector+mosquitoes,+Anopheles+gambiae+and+Aedes+aegypti.">oskar gene expression in the vector mosquitoes, Anopheles gambiae and Aedes aegypti.</a> Insect Mol. Biol. 15, 363-372 (2006).</li><li>Juhn, J., Marinotti, O., Calvo, E., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+structure+and+expression+of+nanos+(nos)+and+oskar+(osk)+orthologues+of+the+vector+mosquito,+Culex+quinquefasciatus.">Gene structure and expression of nanos (nos) and oskar (osk) orthologues of the vector mosquito, Culex quinquefasciatus.</a> Insect Mol. Biol. 17, 545-552 (2008).</li><li>Raminani, L. N., Cupp, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Embryology+of+Aedes+aegypti+(L.)+(Diptera:+Culicidae).">Early Embryology of Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae).</a> Int. J. Insect Morphol. &#38; Embryol. 4, 517-528 (1975).</li><li>Raminani, L. N., Cupp, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryology+of+Aedes+aegypti+(L.)+(Diptera:+Culicidae):+Organogenesis.">Embryology of Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae): Organogenesis.</a> Int. J. Insect morphol. &#38; Embryol. 7, 273-296 (1978).</li><li>Ivanova-Kazas, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+development+of+Anopheles+maculipennis+Mg.">Embryonic development of Anopheles maculipennis Mg.</a> Izv. Akad. Nauk SSSR ser. Biol. 2, 140-170 (1949).</li><li>Goltsev, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+evolutionary+basis+for+drought+tolerance+of+the+Anopheles+gambiae+embryo.">Developmental and evolutionary basis for drought tolerance of the Anopheles gambiae embryo.</a> Dev. Biol. 330, 462-470 (2009).</li><li>Papatsenko, D., Levine, M., Goltsev, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clusters+of+temporal+discordances+reveal+distinct+embryonic+patterning+mechanisms+in+Drosophila+and+Anopheles.">Clusters of temporal discordances reveal distinct embryonic patterning mechanisms in Drosophila and Anopheles.</a> PLoS Biol. 9, e1000584 (2011).</li><li>Davis, C. W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+larval+embryogenesis+in+the+mosquito+Culex+fatigans+Wiedemann+(Diptera:+Culicidae)+and+the+sheep-fly+Lucilla+seriata+Meigen+(Diptera:+Calliphoridae)+I.+Description+of+embryonic+development.">A comparative study of larval embryogenesis in the mosquito Culex fatigans Wiedemann (Diptera: Culicidae) and the sheep-fly Lucilla seriata Meigen (Diptera: Calliphoridae) I. Description of embryonic development.</a> Aust. J. Zool. 15, 547-579 (1967).</li></ol>

Авторы не имеют раскрытия информации.

Гибридизации на месте и колориметрические окрашивания протокол, представленные здесь целых монтажа комаров тканях и эмбрионах полезный прием для локализации протоколов в конкретных органах и типы клеток. Эти процедуры лучше, чем наши сообщалось ранее методы, как в рационализации обширной шаги стирки и предоставление дополнительных технических деталей и реагентов источников. По нашему опыту, колориметрический обнаружение гибридизации сигналов превосходит по чувствительности и четкости сигнала гибридизации по сравнению с флуоресценцией на основе схемы обнаружения. Кроме того колориметрических обнаружения обходит вопросы, связанные с сигналом дискриминации в эмбрионы, которые по своей сути самофлюоресцирующими. Ограничения в обнаружении сигналов гибридизации происходит, когда низкого обилия стенограммы и направлены фоне окрашивание очевидна. Увеличение гибридизации температуры до 65 ° C была обнаружена уменьшить назадземли гибридизации сигналы, но не предложил заменить проектирование уникальной целевой РНК с зондами. Этот протокол используется для выполнения гибридизации на месте целых монтажа слюнных желез Aedes aegypti, и яичники и эмбрионы Anopheles gambiae, Anopheles stephensi, Ae. aegypti и Culex quinquefasciatus. Этот метод также применим и к другим тканям комара, и, возможно, других насекомых. Кроме того, мы собрали в первый раз сравнительный руководящие принципы для постановки эмбрионального развития в трех комаров, Ae. aegypti,. gambiae и Cx. fatigans. Наблюдения были получены для конкретного штамма из этих трех видов, под сдержанный условий выращивания. Важно отметить, что развитие учебного времени может варьироваться для разных штаммов комаров вида и при разных условиях выращивания. Гибридизации на месте дополнения текущих усилий по аначуждой transcriptomes комаров и других членистоногих, и может обеспечить более четкое представление о регуляции экспрессии генов в этих организмах.

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td><td> Комментарии (опционально) </td></tr><tr><td> 0,5 М ЭДТА </td><td> Ambion </td><td> AM9261 </td><td></td></tr><tr><td> 1М Трис-HCl </td><td> Ambion </td><td> AM9855G </td><td> pH8.0 </td></tr><tr><td> 10х PBS </td><td> Ambion </td><td> AM9625 </td><td></td></tr><tr><td> 20-кратный SSC </td><td> Ambion </td><td> AM9763 </td><td></td></tr><tr><td> Пробирки на 1,5 мл микроцентрифужную </td><td> Ambion </td><td> AM12400 </td><td> Менее непрозрачным, чем стандартные трубки; помогает в визуализации образцов </td></tr><tr><td> Деионизированная формамида </td><td> Ambion </td><td> AM9342 </td><td> Хранение при 4 ° C </td></tr><tr><td> DEPC воды </td><td> Ambion </td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Протеиназы K </td><td> Ambion </td><td> AM2546 </td><td></td></tr><tr><td> 5,25% гипохлорит натрия </td><td> Остин </td><td></td><td> A-1 марка </td></tr><tr><td> T3 РНК-полимеразы-Plus </td><td> Ambion </td><td> AM2733 </td><td> Хранение при температуре -20 ° C </td></tr><tr><td> Т7 РНК-полимеразы </td><td> Ambion </td><td> AM2082 </td><td> Хранение при температуре -20 ° C </td></tr><tr><td> 95% этанола </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC61511-0040 </td><td></td></tr><tr><td> Fisherbrand одноразовые пипетки передачи полиэтилена </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-711-7М </td><td></td></tr><tr><td> 37% формальдегида </td><td> Fisher Scientific </td><td> F79-500 </td><td></td></tr><tr><td> ВЭЖХ-класса метанола </td><td> Fisher Scientific </td><td> A452-1 </td><td></td></tr><tr><td> Хлорид магния </td><td> Fisher Scientific </td><td> M87-500 </td><td></td></tr><tr><td> Стекло микроскопа крышкой </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-542A </td><td> 18 x18 мм </td></tr><tr><td> N-гептан </td><td> Fisher Scientific </td><td> H350-1 </td><td></td></tr><tr><td> P-ксилол </td><td> Fisher Scientific </td><td> O5082-500 </td><td></td></tr><tr><td> Pyrex 9-а пластинки с лунками </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-748B </td><td> 100x85 мм </td></tr><tr><td> Хлористый натрий </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC32730-0025 </td><td></td></tr><tr><td> Едкий натр </td><td> Fisher Scientific </td><td> SS255-1 </td><td></td></tr><tr><td> SuperFrost / Plus слайды микроскопом </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-15 </td><td> 25x75x1.0 мм </td></tr><tr><td> Davlyn Красной Clear-лайнер Тупейный лента </td><td> Волосы прямые </td><td> RED-75R12 </td><td> Poly / Кожа материальная база 0,75 х 12 ярд ролл лента </td></tr><tr><td> TOPOTA Cloning Kit для Sequening с одного выстрела Top10 химически компетентных E. палочки </td><td> Invitrogen </td><td> K457501 K457540 </td><td> 20 реакций 40 реакций </td></tr><tr><td> Ультразвуком ДНК спермы лосося </td><td> Invitrogen </td><td> 15632-011 </td><td> Хранение при температуре -20 ° C </td></tr><tr><td> Anti-дигоксигенин-AP Fab фрагментов </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1093274 </td><td> Хранение при 4 ° C </td></tr><tr><td> DIG РНК маркировке смеси </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1277073 </td><td> Хранение при температуре -20 ° C </td></tr><tr><td> NBT / BCIP маточного раствора </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1681451 </td><td> Хранение при 4 ° C </td></tr><tr><td> Западные Блокирование реагентов </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11921673001 </td><td> Хранение при 4 ° C </td></tr><tr><td> Saatilene Hitech полиэфирной сетки (330,130) </td><td> Саати для печати </td><td> 330,34 UO PW </td><td> 330 нитей / дюйм, 34 микрон диаметр резьбы, оранжевый цвет </td></tr><tr><td> Глицерин </td><td> Сигма </td><td> G6279-1 </td><td> 70% PBT </td></tr><tr><td> Гепарин натриевая соль </td><td> Сигма </td><td> H3393 </td><td></td></tr><tr><td> Твин-20 </td><td> Сигма </td><td> P1379-500 </td><td></td></tr><tr><td> 37% формальдегида </td><td> Тед Пелла </td><td> 18508 </td><td> 10 мл порциями в янтаре ампулах </td></tr><tr><td> 16 унций. Соло бумаги контейнеры с крышками </td><td> Бумаги компании </td><td> SOLOKH16AJ8000 </td><td></td></tr><tr><td> Боросиликатного стекла scintillatионных флакон с завинчивающейся крышкой одиноких </td><td> VWR International </td><td> 66022-128 </td><td> 20 мл случае 500 </td></tr><tr><td> Sealed Air Bubble Wrap клеточные прокладочного материала </td><td> VWR International </td><td> 500018-081 </td><td> 10 фут / рулон 0,188 дюймов </td></tr><tr><td> Куриные сыворотке </td><td></td><td></td><td> Цельная кровь была собрана как из крыла вены или пункции сердца с несовершеннолетними курицы. Кровь инкубировали при 37 ° С в течение 1 ч до свертывают и помещают на льду в течение 30 мин. Сыворотки собирали и центрифугировали при 3000 мкг в течение 10 мин. В результате супернатант (топленое сыворотки) собирали и хранили при температуре -20 ° C до использования. </td></tr></tbody></table> Таблица 4. Таблица специфических реагентов и оборудования для гибридизации на месте.

hybridization in situ of salivary glands, ovaries, and embryos of vector mosquitoes

Комары являются переносчиками разнообразных возбудителей арбовирусов в том числе, простейшие паразиты и нематод. Исследование протоколов и генной регуляторов, которые выражаются в тканях, в котором хозяин комаров и возбудителей взаимодействуют, и в органах, участвующих в воспроизводстве представляют большой интерес для стратегии сокращения комарами передачи заболевания и нарушить развитие яиц. Ряд инструментов были использованы для изучения и проверки временных и тканеспецифические регуляции экспрессии генов. Здесь мы рассмотрим протоколы, которые были разработаны для получения пространственной информации, которая усиливает наше понимание того, где конкретные гены экспрессируются и продуктов их накапливать. Протокол описан был использован для проверки выражения и определения накопления моделей протоколов в тканях, связанные с комарами возбудитель передачи, такие, как женщина слюнных желез, а также субклеточном отсеков яичников и эмбрионов, которые повторнопоздно, чтобы комар воспроизводства и развития. Следующая процедура представляет собой оптимизированный методологию, которая повышает эффективность различных шагов в протокол без потери целевой конкретные сигналы гибридизации. Руководство по подготовке РНК зонд, рассечение мягких тканей и общий порядок фиксации и гибридизации описаны в Части А, в то время как конкретные шаги по сбору, фиксации, предварительно гибридизации и гибридизации эмбрионов комаров подробно в части В.

Watch this Scientific Journal Video about Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes at JoVE.com

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Временные и пространственные анализ экспрессии гена играют важную роль в области функциональной геномики. Всего монтажа гибридизации<em&gt; На месте</em&gt; Используется для определения локализации транскриптов в тканях и субклеточных отсеков. Здесь мы приводим гибридизации<em&gt; На месте</em&gt; Протокол с изменениями конкретных тканях в комаров.

Гибридизация<em&gt; На месте</em&gt; Слюнных желез, яичников, а также эмбрионы комаров

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Сочетание Клей-ленты на основе выборки и флуоресценции На месте Гибридизация для быстрого обнаружения Сальмонеллы На Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Выявление инфекционных Касперского с поля, собранные Комары от Vero Пробирной культуры клеток

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Слюна, слюнные железы, и гемолимфы Коллекция от иксодовых клещей Scapularis

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Флуоресцентный<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизации на митотических хромосом от комаров

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

Метод для измерения функции слюнной железы у мышей

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Количественная флуоресценция в ситу Гибридизации (FISH) и иммунофлуоресценции (ИФ) специфических генных продуктов в KSHV-зараженных клетках

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers

Изоляция слюнных эпителиальных клеток от слюнных желез человека для роста провитроки как салисферы или монослои

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Визуализация Candida Albicans в Желудочно-кишечном тракте Мурина с использованием флуоресцентных в ситу гибридизации

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Анализ компетентности переносчиков комаров Aedes aegypti с использованием вируса Зика

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

Визуализация ТОРС-КоВ-2 с использованием иммуноРНК-флуоресценции в гибридизации Ситус

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...