Name: hybridization in situ of salivary glands, ovaries, and embryos of vector mosquitoes
Uploaded: 2012-06-28T12:00:00
Duration: 10 min 58 s
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Los autores desean agradecer a Marika Walters para el asesoramiento en el desarrollo de la hibridación in situ en los métodos de los tejidos blandos y Goltsev Yury para la discusión de los protocolos para la hibridación in situ de Anopheles gambiae embriones, que fueron adaptados y modificados posteriormente para desarrollar el protocolo descrito aquí para la hibridación en in situ de Aedes y Culex embriones. Reconocemos también recomendaciones útiles dados por Adam Paré y Kosman David. Damos las gracias a Osvaldo Marinotti para la discusión científica y la edición del texto del protocolo.

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	<li>Juhn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+mapping+of+gene+expression+in+the+salivary+glands+of+the+dengue+vector+mosquito,+Aedes+aegypti.">Spatial mapping of gene expression in the salivary glands of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti.</a> Parasit. Vectors. 4, 1 (2011).</li><li>Coleman, J., Juhn, J., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+midgut+and+salivary+glands+from+Ae.+aegypti+mosquitoes.">Dissection of midgut and salivary glands from Ae. aegypti mosquitoes.</a> J. Vis. Exp. (5), e228 (2007).</li><li>Benedict, M. 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Los autores no tienen revelaciones.

La hibridación in situ y el protocolo de tinción colorimétrica que aquí se presenta para los tejidos de mosquitos todo el montaje y los embriones es una técnica útil para la localización de las transcripciones en órganos específicos y tipos de células. Estos procedimientos son una mejora con respecto a los métodos ya se ha informado, tanto en la racionalización de amplias medidas de lavado y de proporcionar más detalles técnicos y las fuentes de reactivos. En nuestra experiencia, la detección colorimétrica de las señales de hibridación es superior en sensibilidad y la claridad de la señal de hibridación en comparación con esquemas de detección basadas en fluorescencia. Por otra parte la detección colorimétrica elude las cuestiones relacionadas con la discriminación de la señal en los embriones, que son inherentemente auto-fluorescente. Las limitaciones en la detección de señales de hibridación ocurre, cuando baja abundancia transcripciones están dirigidos y tinción de fondo es evidente. El aumento de la temperatura de hibridación a 65 ° C se ha encontrado para reducir de nuevoseñales de hibridación de tierra, pero no es un sustituto sugerido para el diseño único objetivo sondas específicas de ARN. Este protocolo se ha utilizado para llevar a cabo la hibridación in situ de todo el montaje las glándulas salivales del mosquito Aedes aegypti y los ovarios y los embriones de Anopheles gambiae, el Anopheles stephensi, Ae. aegypti y Culex quinquefasciatus. Este método también es aplicable a los tejidos de mosquitos otros, y presumiblemente los de otros insectos. Además, se compiló para las pautas de la primera vez comparativas para la puesta en escena del desarrollo embrionario de cada tres mosquitos vectores, Ae. aegypti, Un. gambiae y Cx. fatigans. Las observaciones se han reportado para cepas específicas de estas tres especies, bajo condiciones de cría discretos. Es importante señalar que el curso de tiempo de desarrollo puede variar para diferentes cepas de especies de mosquitos y bajo condiciones de cría diferentes. Hibridaciones en el suplemento in situ los esfuerzos en curso a analisar los transcriptomes de mosquitos y otros artrópodos, y puede ofrecer una mejor imagen de la regulación de la expresión génica en estos organismos.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> EDTA 0,5 M </td><td> Ambion </td><td> AM9261 </td><td></td></tr><tr><td> Tris-HCl 1M </td><td> Ambion </td><td> AM9855G </td><td> pH 8,0 </td></tr><tr><td> PBS 10 veces </td><td> Ambion </td><td> AM9625 </td><td></td></tr><tr><td> SSC 20X </td><td> Ambion </td><td> AM9763 </td><td></td></tr><tr><td> 1,5 ml tubos de microfuga </td><td> Ambion </td><td> AM12400 </td><td> Menos opaco que los tubos estándar, ayuda a visualizar las muestras </td></tr><tr><td> Formamida desionizada </td><td> Ambion </td><td> AM9342 </td><td> El almacenamiento a 4 ° C </td></tr><tr><td> DEPC agua </td><td> Ambion </td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinasa K </td><td> Ambion </td><td> AM2546 </td><td></td></tr><tr><td> 5,25% de hipoclorito de sodio </td><td> Austin </td><td></td><td> A-1 Marca </td></tr><tr><td> T3 ARN polimerasa-Plus </td><td> Ambion </td><td> AM2733 </td><td> El almacenamiento a -20 ° C </td></tr><tr><td> T7 ARN polimerasa </td><td> Ambion </td><td> AM2082 </td><td> El almacenamiento a -20 ° C </td></tr><tr><td> 95% de etanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC61511-0040 </td><td></td></tr><tr><td> Fisherbrand pipetas desechables de polietileno de transferencia </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-711-7M </td><td></td></tr><tr><td> 37% de formaldehído </td><td> Fisher Scientific </td><td> F79-500 </td><td></td></tr><tr><td> HPLC-grado de metanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A452-1 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro de magnesio </td><td> Fisher Scientific </td><td> M87-500 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio cubierta de vidrio </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-542A </td><td> 18 x 18 mm </td></tr><tr><td> N-heptano </td><td> Fisher Scientific </td><td> H350-1 </td><td></td></tr><tr><td> P-xileno </td><td> Fisher Scientific </td><td> O5082-500 </td><td></td></tr><tr><td> Pyrex de 9 y Punto Plate </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-748B </td><td> 100x85 mm </td></tr><tr><td> Cloruro de sodio </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC32730-0025 </td><td></td></tr><tr><td> Hidróxido de sodio </td><td> Fisher Scientific </td><td> SS255-1 </td><td></td></tr><tr><td> Superfrost / Plus portaobjetos </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-15 </td><td> 25x75x1.0 mm </td></tr><tr><td> Davlyn Red Clear-liner Toupee cinta </td><td> Cabello directo </td><td> RED-75R12 </td><td> Poli / material de la piel base de 0,75 cm x 12 m rollo de cinta </td></tr><tr><td> Kit de Clonación de TOPOTA Sequening con un disparo Top10 químicamente competente E. E. </td><td> Invitrogen </td><td> K457501 K457540 </td><td> 20 reacciones 40 reacciones </td></tr><tr><td> De salmón sonicado ADN de los espermatozoides </td><td> Invitrogen </td><td> 15632-011 </td><td> El almacenamiento a -20 ° C </td></tr><tr><td> Anti-digoxigenina-AP Fab </td><td> Roche Ciencias Aplicadas </td><td> 1093274 </td><td> El almacenamiento a 4 ° C </td></tr><tr><td> DIG RNA etiquetado mezcla </td><td> Roche Ciencias Aplicadas </td><td> 1277073 </td><td> El almacenamiento a -20 ° C </td></tr><tr><td> NBT / BCIP de la solución madre </td><td> Roche Ciencias Aplicadas </td><td> 1681451 </td><td> El almacenamiento a 4 ° C </td></tr><tr><td> Reactivo de bloqueo occidental </td><td> Roche Ciencias Aplicadas </td><td> 11921673001 </td><td> El almacenamiento a 4 ° C </td></tr><tr><td> Saatilene Hitech malla de poliéster (330.130) </td><td> Saati Imprimir </td><td> 330,34 UO PW </td><td> 330 hilos por pulgada, de 34 micras de diámetro de la rosca, color naranja </td></tr><tr><td> Glicerol </td><td> Sigma </td><td> G6279-1 </td><td> 70% en PBT </td></tr><tr><td> Sal de sodio de heparina </td><td> Sigma </td><td> H3393 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma </td><td> P1379-500 </td><td></td></tr><tr><td> 37% de formaldehído </td><td> Ted Pella </td><td> 18508 </td><td> Alícuotas de 10 ml en ampollas ámbar </td></tr><tr><td> 16 oz Recipientes con tapas de papel solitario </td><td> El Paper Company </td><td> SOLOKH16AJ8000 </td><td></td></tr><tr><td> Vidrio borosilicato scintillatión vial con tapón de rosca sin ataduras </td><td> VWR International </td><td> 66022-128 </td><td> 20 ml caso de 500 </td></tr><tr><td> Sealed Air Bubble Wrap o via un material de relleno </td><td> VWR International </td><td> 500018-081 </td><td> De 10 pies / rollo 0.188 pulgadas de espesor </td></tr><tr><td> Suero de pollo </td><td></td><td></td><td> Toda la sangre se recoge ya sea desde la vena del ala, o por punción cardiaca de un pollo de menores. La sangre se incubó a 37 ° C durante 1 h hasta coagulada y luego se coloca en hielo durante 30 min. El suero se recogió y se centrifugó a 3000 xg durante 10 min. El sobrenadante resultante (aclarado suero) se recogió y se almacenó a -20 ° C hasta su uso. </td></tr></tbody></table> Tabla 4. Tabla de los reactivos específicos y equipos para la hibridación in situ.

hybridization in situ of salivary glands, ovaries, and embryos of vector mosquitoes

Los mosquitos son vectores de un conjunto diverso de agentes patógenos como los arbovirus, parásitos protozoarios y nematodos. Investigación de las transcripciones y los reguladores de genes que se expresan en tejidos en los que el anfitrión de mosquitos e interactuar patógeno, y en los órganos implicados en la reproducción son de gran interés para las estrategias para reducir la transmitida por el mosquito transmisión de la enfermedad e interrumpir el desarrollo del óvulo. Un número de herramientas se han empleado para estudiar y validar la regulación temporal y tejidos específicos de la expresión génica. A continuación, describimos los protocolos que han sido desarrollados para obtener la información espacial, lo que aumenta nuestra comprensión de los genes específicos en donde se expresan y acumulan sus productos. El protocolo descrito se ha utilizado para validar la expresión y de determinar los patrones de acumulación de expedientes en los tejidos relacionados con la transmitida por el mosquito transmisión de patógenos, tales como las mujeres las glándulas salivales, así como los compartimentos subcelulares de los ovarios y los embriones, que vuelva atarde para la reproducción de mosquitos y el desarrollo. Los procedimientos siguientes representan una metodología optimizada que mejora la eficiencia de varios pasos en el protocolo sin pérdida de las señales de hibridación específicos diana. Directrices para la preparación de la sonda de ARN, la disección de los tejidos blandos y el procedimiento general para la fijación y la hibridación se describen en la Parte A, mientras que los pasos específicos para la recogida, grabación, pre-hibridación y la hibridación de embriones de mosquitos se detallan en la Parte B.

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Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Análisis de genes temporales y espaciales de expresión tiene un papel crucial en la genómica funcional. Todo el montaje hibridación<em&gt; In situ</em&gt; Es útil para determinar la localización de las transcripciones dentro de los tejidos y los compartimentos subcelulares. Aquí describimos una hibridación<em&gt; In situ</em&gt; Protocolo con las modificaciones de los tejidos diana específicos en los mosquitos.

Hibridación<em&gt; In situ</em&gt; De las glándulas salivales, los ovarios y embriones de los mosquitos vectores

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