Name: hybridization in situ of salivary glands, ovaries, and embryos of vector mosquitoes
Uploaded: 2012-06-28T12:00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes at JoVE.com

Författarna vill tacka Marika Walters för att få råd att utveckla hybridisering in situ metoder för mjuka vävnader och Yury Goltsev för diskussion av protokoll för hybridisering in situ av Anopheles gambiae embryon, vilka sedermera anpassas och modifieras för att utveckla protokoll som beskrivs här för hybridisering i plats av Aedes och embryon Culex. Vi erkänner också användbara rekommendationer som ges av Adam Paré och David Kosman. Vi tackar Osvaldo Marinotti för vetenskaplig diskussion och redigera protokollet texten.

<ol>
	<li>Juhn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+mapping+of+gene+expression+in+the+salivary+glands+of+the+dengue+vector+mosquito,+Aedes+aegypti.">Spatial mapping of gene expression in the salivary glands of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti.</a> Parasit. Vectors. 4, 1 (2011).</li><li>Coleman, J., Juhn, J., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+midgut+and+salivary+glands+from+Ae.+aegypti+mosquitoes.">Dissection of midgut and salivary glands from Ae. aegypti mosquitoes.</a> J. Vis. Exp. (5), e228 (2007).</li><li>Benedict, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+Plasmodium-infected+Mosquitoes:+Salivary+Glands,+Chapter.+5.4.2.">Dissecting Plasmodium-infected Mosquitoes: Salivary Glands, Chapter. 5.4.2.</a> Methods in Anopheles Research. , (2007).</li><li>Sappington, T. W., Brown, M. R., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+analysis+of+insect+ovaries,+Chapter.+42.3.">Culture and analysis of insect ovaries, Chapter. 42.3.</a> The Molecular Biology of Insect Disease Vectors: A methods manual. , (1997).</li><li>Goltsev, Y., Hsiong, W., Lanzaro, G., Levine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+combinations+of+gap+repressors+for+common+stripes+in+Anopheles+and+Drosophila+embryos.">Different combinations of gap repressors for common stripes in Anopheles and Drosophila embryos.</a> Dev. Biol. 275, 435-446 (2004).</li><li>Benedict, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anopheles+Embryo+Fixation,+Chapter.+3.7.">Anopheles Embryo Fixation, Chapter. 3.7.</a> Methods in Anopheles Research. Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4). , (2007).</li><li>Juhn, J., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=oskar+gene+expression+in+the+vector+mosquitoes,+Anopheles+gambiae+and+Aedes+aegypti.">oskar gene expression in the vector mosquitoes, Anopheles gambiae and Aedes aegypti.</a> Insect Mol. Biol. 15, 363-372 (2006).</li><li>Juhn, J., Marinotti, O., Calvo, E., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+structure+and+expression+of+nanos+(nos)+and+oskar+(osk)+orthologues+of+the+vector+mosquito,+Culex+quinquefasciatus.">Gene structure and expression of nanos (nos) and oskar (osk) orthologues of the vector mosquito, Culex quinquefasciatus.</a> Insect Mol. Biol. 17, 545-552 (2008).</li><li>Raminani, L. N., Cupp, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Embryology+of+Aedes+aegypti+(L.)+(Diptera:+Culicidae).">Early Embryology of Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae).</a> Int. J. Insect Morphol. &#38; Embryol. 4, 517-528 (1975).</li><li>Raminani, L. N., Cupp, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryology+of+Aedes+aegypti+(L.)+(Diptera:+Culicidae):+Organogenesis.">Embryology of Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae): Organogenesis.</a> Int. J. Insect morphol. &#38; Embryol. 7, 273-296 (1978).</li><li>Ivanova-Kazas, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+development+of+Anopheles+maculipennis+Mg.">Embryonic development of Anopheles maculipennis Mg.</a> Izv. Akad. Nauk SSSR ser. Biol. 2, 140-170 (1949).</li><li>Goltsev, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+evolutionary+basis+for+drought+tolerance+of+the+Anopheles+gambiae+embryo.">Developmental and evolutionary basis for drought tolerance of the Anopheles gambiae embryo.</a> Dev. Biol. 330, 462-470 (2009).</li><li>Papatsenko, D., Levine, M., Goltsev, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clusters+of+temporal+discordances+reveal+distinct+embryonic+patterning+mechanisms+in+Drosophila+and+Anopheles.">Clusters of temporal discordances reveal distinct embryonic patterning mechanisms in Drosophila and Anopheles.</a> PLoS Biol. 9, e1000584 (2011).</li><li>Davis, C. W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+larval+embryogenesis+in+the+mosquito+Culex+fatigans+Wiedemann+(Diptera:+Culicidae)+and+the+sheep-fly+Lucilla+seriata+Meigen+(Diptera:+Calliphoridae)+I.+Description+of+embryonic+development.">A comparative study of larval embryogenesis in the mosquito Culex fatigans Wiedemann (Diptera: Culicidae) and the sheep-fly Lucilla seriata Meigen (Diptera: Calliphoridae) I. Description of embryonic development.</a> Aust. J. Zool. 15, 547-579 (1967).</li></ol>

Författarna har inga upplysningar.

Hybridiseringen in situ och kolorimetrisk färgning protokoll som presenteras här för Whole-mount mygga vävnader och embryon är en användbar teknik för lokalisering av transkript i specifika organ och celltyper. Dessa förfaranden är en förbättring jämfört med våra tidigare rapporterade metoder, både för att effektivisera omfattande tvättsteg och ge ytterligare tekniska detaljer och källor reagens. Enligt vår erfarenhet är kolorimetrisk detektering av hybridiseringssignaler överlägsen känslighet och skärpa av hybridiseringssignal jämfört med fluorescensbaserade detekteringsscheman. Dessutom kolorimetrisk upptäckt kringgår frågor i samband med signalen diskriminering embryon, som är inneboende auto-fluorescerande. Begränsningar i att upptäcka hybridiseringssignaler uppstår när låg-överflöd transkript är riktade och bakgrund färgning är uppenbart. Att öka hybridiseringshastigheten temperaturen till 65 ° C har befunnits reducera tillbakamarken hybridiseringssignaler, men är inte ett förslag ersättning för att utforma en unik målspecifika RNA-prober. Detta protokoll har använts för att utföra hybridisering in situ av hela mount salivkörtlar av Aedes aegypti, och äggstockar och embryon från Anopheles gambiae, Anopheles stephensi, Ae. aegypti och Culex quinquefasciatus. Denna metod är också applicerbar på andra mygga vävnader, och förmodligen de som av andra insekter. Dessutom sammanställt vi för första gången jämförande riktlinjer för iscensättningen av embryonal utveckling i tre vektor myggor, Ae. aegypti, An. gambiae och Cx. fatigans. Observationer har rapporterats för specifika stammar av dessa tre arter, under diskreta häckningen. Det är viktigt att notera att den utvecklande tidsförloppet kan variera för olika stammar av myggarter och under olika uppfödningssystem förhållanden. Hybridiseringar på plats tillägg pågående insatser för att anaLyze de transcriptomes av myggor och andra leddjur, och kan ge en bättre bild av regleringen av genuttryck i dessa organismer.

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet på reagens </td><td> Företaget </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (valfri) </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA </td><td> Ambion </td><td> AM9261 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl </td><td> Ambion </td><td> AM9855G </td><td> pH 8,0 </td></tr><tr><td> 10 X PBS </td><td> Ambion </td><td> AM9625 </td><td></td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td> Ambion </td><td> AM9763 </td><td></td></tr><tr><td> 1,5 ml mikrocentrifugrör </td><td> Ambion </td><td> AM12400 </td><td> Mindre ogenomskinligt än vanliga rör, stöd i att visualisera prover </td></tr><tr><td> Avjoniserad formamid </td><td> Ambion </td><td> AM9342 </td><td> Lagring vid 4 ° C </td></tr><tr><td> DEPC vatten </td><td> Ambion </td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinas K </td><td> Ambion </td><td> AM2546 </td><td></td></tr><tr><td> 5,25% natriumhypoklorit </td><td> Austin </td><td></td><td> A-1 Brand </td></tr><tr><td> T3 RNA-polymeras-Plus </td><td> Ambion </td><td> AM2733 </td><td> Lagring vid -20 ° C </td></tr><tr><td> T7 RNA-polymeras </td><td> Ambion </td><td> AM2082 </td><td> Lagring vid -20 ° C </td></tr><tr><td> 95% Etanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC61511-0040 </td><td></td></tr><tr><td> Fisherbrand engångstyp polyeten överföringspipetter </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-711-7M </td><td></td></tr><tr><td> 37% formaldehyd </td><td> Fisher Scientific </td><td> F79-500 </td><td></td></tr><tr><td> HPLC-kvalitet metanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A452-1 </td><td></td></tr><tr><td> Magnesiumklorid </td><td> Fisher Scientific </td><td> M87-500 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop skyddsglas </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-542A </td><td> 18 x18 mm </td></tr><tr><td> N-heptan </td><td> Fisher Scientific </td><td> H350-1 </td><td></td></tr><tr><td> P-xylen </td><td> Fisher Scientific </td><td> O5082-500 </td><td></td></tr><tr><td> Pyrex 9-samt Spot Plate </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-748B </td><td> 100x85 mm </td></tr><tr><td> Natriumklorid </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC32730-0025 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumhydroxid </td><td> Fisher Scientific </td><td> SS255-1 </td><td></td></tr><tr><td> SuperFrost / Plus objektglas </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-15 </td><td> 25x75x1.0 mm </td></tr><tr><td> Davlyn Röd Klar-liner tupén tejp </td><td> Hår Direkt </td><td> RED-75R12 </td><td> Poly / Hud grundmaterial 0,75 cm x 12 m tejprulle </td></tr><tr><td> TOPOTA Kloning Kit för Sequening med ett skott Top10 kemiskt kompetent E. coli </td><td> Invitrogen </td><td> K457501 K457540 </td><td> 20 reaktioner 40 reaktioner </td></tr><tr><td> Sonikerat laxsperma-DNA </td><td> Invitrogen </td><td> 15632-011 </td><td> Lagring vid -20 ° C </td></tr><tr><td> Anti-digoxigenin-AP Fab-fragment </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1093274 </td><td> Lagring vid 4 ° C </td></tr><tr><td> DIG RNA märkning mix </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1277073 </td><td> Lagring vid -20 ° C </td></tr><tr><td> NBT / BCIP-stamlösning </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1681451 </td><td> Lagring vid 4 ° C </td></tr><tr><td> Västra Blocking Reagent </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11921673001 </td><td> Lagring vid 4 ° C </td></tr><tr><td> Saatilene Hitech polyesternät (330,130) </td><td> Saati ut </td><td> 330,34 UO PW </td><td> 330 trådar / tum, 34 mikron tråd diameter, orange färg </td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> Sigma </td><td> G6279-1 </td><td> 70% i PBT </td></tr><tr><td> Heparin-natriumsalt </td><td> Sigma </td><td> H3393 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma </td><td> P1379-500 </td><td></td></tr><tr><td> 37% formaldehyd </td><td> Ted Pella </td><td> 18.508 </td><td> 10 ml portioner i bärnsten ampuller </td></tr><tr><td> 16 oz. Solo Paper behållare med lock </td><td> The Paper Company </td><td> SOLOKH16AJ8000 </td><td></td></tr><tr><td> Borsilikatglas scintillatjon injektionsflaska med lös skruvlock </td><td> VWR International </td><td> 66022-128 </td><td> 20 ml vid 500 </td></tr><tr><td> Sealed Air Bubbelplast celluar stötdämpande material </td><td> VWR International </td><td> 500018-081 </td><td> 10 fot / rulle 0,188 inches tjock </td></tr><tr><td> Kycklingserum </td><td></td><td></td><td> Helblod uppsamlades antingen från vingen ven eller genom hjärtpunktion från en ung kyckling. Blodet inkuberades vid 37 ° C under 1 h tills koagulerade och placerades sedan på is under 30 minuter. Serum samlades upp och centrifugerades vid 3000 xg under 10 min. Den resulterande supernatanten (klargöras serum) uppsamlades och lagrades vid -20 ° C fram till användning. </td></tr></tbody></table> Tabell 4. Tabell över specifika reagens och utrustning för hybridisering in situ.

hybridization in situ of salivary glands, ovaries, and embryos of vector mosquitoes

Myggor är vektorer för en mängd olika patogener, inklusive arbovirus, protozoiska parasiter och nematoder. Undersökning av avskrifter och lagstiftare gen som uttrycks i vävnader där mygga värd och patogen interagera och i organ som deltar i reproduktionen är av stort intresse för strategier för att minska myggor smittspridning och störa ägg utveckling. Ett antal verktyg har använts för att studera och validera den tidsmässiga och vävnadsspecifika reglering av genuttryck. Här beskriver vi protokoll som har utvecklats för att få geografisk information, vilket ökar vår förståelse för där specifika gener uttrycks och deras produkter samlas. Protokollet som beskrivs har använts för att validera uttryck och bestämma ackumulering mönster av transkript i vävnader i samband med myggor patogen överföring, såsom kvinnliga spottkörtlar samt subcellulära fack av äggstockar och embryon som ärsent att mygga reproduktion och utveckling. Följande procedurer utgör en optimerad metod som förbättrar effektiviteten hos olika steg i protokollet utan förlust av mål-specifika hybridiseringssignaler. Riktlinjer för RNA-prob förberedelse, är dissekering av mjuka vävnader och det allmänna förfarandet för fixering och hybridisering som beskrivs i del A, medan åtgärder som är specifika för insamling, fixering, pre-hybridisering och hybridisering av mygga embryon beskrivs i del B.

Watch this Scientific Journal Video about Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes at JoVE.com

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Temporala och spatiala genuttryck analyser har en avgörande roll i funktionsgenomik. Hela-mount hybridisering<em&gt; In situ</em&gt; Är användbar för bestämning av lokalisering av transkript i vävnader och subcellulära utrymmen. Här redogör vi för en hybridisering<em&gt; In situ</em&gt; Protokoll med modifikationer för specifika målvävnader i myggor.

Hybridisering<em&gt; In situ</em&gt; Av spottkörtlar, äggstockar, och embryon av Vector myggor

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Kombination av självhäftande tejp grundad på provtagning och fluorescens På plats Hybridisering för snabb upptäckt av Salmonella På färskvaror

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Detektion av infektiösa virus från Field-in Myggor av vero-cellodling analys

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliv, spottkörtel och hemolymfa Collection från Ixodes scapularis fästingar

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Lysrör<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering på Mitotiska kromosomer myggor

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

En metod för mätning av Saliv-körtel funktion hos möss

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Kvantitativ fluorescens i situ-hybridisering (fisk) och Immunofluorescensbildning (IF) av specifika genprodukter i KSHV-infekterade celler

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers

Isolering av saliv epitelceller från mänskliga spottkörtlar för in vitro-tillväxt som Salispheres eller Monolayers

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualisering av Candida albicans i murin mag-tarmkanalen med fluorescerande in situ hybridisering

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Vektorkompetensanalyser på Aedes aegypti myggor med Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

Visualisering av SARS-CoV-2 med immun RNA-fluorescens i Situ hybridisering

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...